趙靜安，解立新

肺癌是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤的第一位[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌類型，占全部肺癌的80%～85%，患者5年生存率低于15%，早期侵襲和轉(zhuǎn)移是導致NSCLC患者死亡的最主要原因[3]。miRNA是長度為18～22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA分子3'-UTR端特異性結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達，進而參與調(diào)控包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，深入研究其相關(guān)分子機制對NSCLC的診斷和治療有重要意義[4-5]。miR-598作為一個重要的抑癌miRNA分子，可通過調(diào)控JAG1、IGF-1R、DERL1等基因表達，參與腫瘤細胞的周期調(diào)控、遷移，侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[6-9]。不僅如此，miR-598的低表達還與多種腫瘤的不良預后密切相關(guān)，因此miR-598可作為預測腫瘤進展和預后的標志物[10]。RNA結(jié)合蛋白Musashi2(MSI2)是NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的一個重要調(diào)控因子，這可能與MSI2激活TGF-β信號通路有著密切關(guān)系。本研究探討了miR-598在非小細胞肺癌組織中的表達，以及miRNA-598靶定MSI2 NSCLC細胞遷移和侵襲的影響，以期為NSCLC的診斷及治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料獲取 收集2015年8月－2017年3月在解放軍總醫(yī)院胸外科行原發(fā)性NSCLC切除術(shù)的患者37例，入組患者術(shù)前均未接受放療或者化療。其中男18例，女19例，年齡(56.7±8.9)歲；鱗癌23例，腺癌14例。組織標本包括患者原發(fā)性NSCLC組織和癌旁組織(距離病灶＞5cm，并有病理證實無腫瘤細胞浸潤)，切取后迅速凍于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞株A549、H1650、H1299及人正常肺上皮細胞BEAS-2B均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。所有細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司，美國)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 qRT-PCR實驗 應(yīng)用Trizol法提取組織和細胞的總RNA。采用TapMan MicroRNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems公司，美國)進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16℃ 30min；42℃ 30min；85℃ 5min。采用TapMan MicroRNA Assays Real-time PCR kit(Applied Biosystems公司，美國)進行定量擴增，反應(yīng)條件為：95℃ 5min，95℃ 15s、62℃30s，共40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照。miR-598引物序列：正向5'-AGCTACGTCATCGTTGTCATC-3'，反向5'-GTGTCGTCGAGTCGGCAATTC-3'；MSI2引物序列：正向5'-TTCGCAGACCCAGCAAGTG-3'，反向5'-TCGCAGATAACCCGCCTAC-3'；U6引物序列：正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'(華大基因公司，中國)。每個檢驗指標設(shè)3個復孔，用2-ΔΔCt法定量miR-598的相對表達水平。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染實驗 待A549細胞生長到80%左右時，采用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)轉(zhuǎn)染試劑將miRNA對照(miR-NC)、miR-598mimics及miR-598 inhibitors轉(zhuǎn)染至A549細胞，8h后更換新鮮培養(yǎng)基，48h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 劃痕愈合實驗 將轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-598 mimics以及miR-598 inhibitors的A549細胞接種至6孔板，待細胞鋪滿孔底，用10μl無菌移液器槍頭在培養(yǎng)板底部進行“一”字形劃痕，PBS洗3次后加入低血清新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察0、12、24、36h后劃痕中細胞的遷移情況并拍照。沿劃痕邊緣等間距取3處測量劃痕寬度，取平均值。劃痕愈合率(%)=(0h劃痕寬度－觀察時間劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 采用預鋪Matrigel基質(zhì)膠的8μm規(guī)格的聚碳酸酯濾膜培養(yǎng)小室(Corning公司，美國)進行Transwell實驗。將轉(zhuǎn)染miR-598 mimics、miR-598 inhibitors以及miR-NC的A549細胞制成1×105/ml密度的細胞懸液，并接種200μl細胞懸液到Transwell小室的上室，下室加入500μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復孔。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)36h后，用棉簽輕輕擦掉基質(zhì)膠和上層未穿膜的細胞，4%多聚甲醛固定細胞10min，0.1%結(jié)晶紫染色10min，100倍顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，取平均數(shù)為每組穿過小室的細胞數(shù)。

1.2.6 靶基因預測 通過miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirbase.org/)3種在線軟件進行靶基因預測，選擇至少在2個軟件中出現(xiàn)并且與腫瘤遷移、侵襲功能密切相關(guān)的基因進一步分析。

1.2.7 MSI2基因3'-UTR及突變載體構(gòu)建 根據(jù)生物信息學預測的miR-598與MSI2 3'-UTR區(qū)靶位點結(jié)合情況合成MSI2目的基因序列和突變序列，以pGL3為載體，XhoⅠ和KpnⅠ為插入位點，采用XhoⅠ/KpnⅠ雙酶切系統(tǒng)(20μl體系)(TaKaRa公司，日本)于37℃下酶切1h，對載體酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因和載體片段。連接目的基因與載體，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞驗證后完成質(zhì)粒抽提。最終獲得MSI2基因野生型質(zhì)粒miR-NC+pGL3-MSI2-wt和miR-598mimics+pGL3-MSI2-wt，MSI2基因突變型質(zhì)粒miR-NC+pGL3-MSI2-mut和miR-598mimics+pGL3-MSI2-mut。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測 293FT細胞接種24孔板(1.5×105/孔)，待細胞生長至80%左右，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司，中國)說明書將質(zhì)粒miR-NC+pGL3-MSI2-wt、miR-598mimics+pGL3-MSI2-wt、miR-NC+pGL3-MSI2-mut、miR-598mimics+pGL3-MSI2-mut分別共轉(zhuǎn)染293FT細胞，6h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后，裂解各組細胞，按Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司，美國)說明書操作，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性比值表示各組細胞熒光強度。

1.2.9 Western blotting檢測蛋白表達水平 將轉(zhuǎn)染miR-NC+pcDNA、miR-NC+MSI2、miR-598 mimics+MSI2后的A549細胞采用RIPA于冰上裂解30min，采用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司，中國)定量。采用12%SDS-PAGE膠進行凝膠電泳分離，每個泳道蛋白上樣量為20μg。濃縮膠60V電泳1h，分離膠100V電泳2h，常規(guī)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90min，用含5%牛血清白蛋白的TBST緩沖液封閉1h，分別加入對應(yīng)一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次后，加入對應(yīng)二抗室溫搖床孵育2h，TBST緩沖液洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒(Thermo公司，美國)發(fā)光顯影，定影后進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-598在NSCLC組織及細胞系中的表達 通過qRT-PCR檢測37例NSCLC組織及癌旁組織中miR-598的表達水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中miR-598的表達明顯下調(diào)(P＜0.001，圖1A)。與人正常肺上皮細胞BEAS-2B相比，肺癌細胞系A(chǔ)549、H1650及H1299中miR-598的表達也明顯下調(diào)(P＜0.001，圖1B)。

2.2 miR-598對NSCLC細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)相比，轉(zhuǎn)染miR-598 mimics的A549細胞遷移能力受到明顯抑制(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-598 inhibitors的細胞遷移能力明顯增強(P＜0.01，圖2A、B)。

圖1 miR-598在NSCLC組織及細胞系中的相對表達水平Fig.1 Relative expressions of miR-598 in NSCLC tissues and cell lines

圖2 miR-598對A549細胞遷移能力的影響Fig.2 Inhibition effect of miR-598 on migration of A549 cells

2.3 miR-598對肺癌細胞侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC的陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-598 mimics的A549細胞侵襲能力明顯減弱(P＜0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-598 inhibitors的A549細胞侵襲能力明顯增強(P＜0.05，圖3A、B)。

2.4 miR-598與MSI2的相互作用 生物信息學軟件分析顯示，miR-598與致癌基因MSI2的3'-UTR存在多個堿基結(jié)合位點，MSI2可能是miR-598的靶基因(圖4A)。隨后采用雙熒光素酶報告基因體系分別構(gòu)建了MSI2野生型(MSI2-wt)及MSI2突變型(MSI2-mut)熒光素酶報告載體質(zhì)粒，并通過與miR-598 mimics共同轉(zhuǎn)染293FT細胞來檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示，miR-598 mimics可顯著抑制MSI2野生型熒光素酶活性(P＜0.01)，而不影響MSI2突變型熒光素酶活性(圖4B)。隨后檢測過表達miR-598 mimics的A549細胞中MSI2 mRNA的表達水平，結(jié)果顯示其表達水平明顯降低(P＜0.01，圖4C)。

2.5 miR-598調(diào)控MSI2對NSCLC細胞遷移和侵襲的影響 通過在A549細胞中單獨或與miR-598 mimics共轉(zhuǎn)染MSI2基因，發(fā)現(xiàn)單獨轉(zhuǎn)染后MSI2蛋白表達水平升高，而與miR-598 mimics共轉(zhuǎn)染后MSI2蛋白表達水平恢復正常，表明miR-598抑制NSCLC細胞的遷移和侵襲是通過調(diào)控MSI2實現(xiàn)的(圖5A)。劃痕實驗顯示，MSI2可明顯增強A549細胞的遷移能力，但當引入miR-598 mimics后A549細胞的遷移能力明顯被逆轉(zhuǎn)(圖5B)。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，MSI2可以明顯強A549細胞的侵襲能力，但引入miR-598后，A549細胞的侵襲能力明顯被逆轉(zhuǎn)(圖5C)。檢測NSCLC組織中miR-598和MSI2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)二者呈明顯負相關(guān)(圖5D)。

圖3 miR-598對A549細胞侵襲能力的影響Fig.3 Inhibition effect of miR-598 on invasion of A549 cells

圖4 miR-598與MSI2基因3'-UTR區(qū)的相互作用(雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?Fig.4 Interaction between miR-598 and MSI2 detected by dual-luciferase test

圖5 miR-598通過調(diào)控MSI2抑制肺癌細胞的遷移和侵襲Fig.5 Inhibition effect of miR-598 on migration and invasion of NSCLC by regulating MSI2

3 討 論

目前研究認為，miRNA與肺癌細胞的分化、增殖、侵襲、凋亡等密切相關(guān)[11]。miRNA既可以下調(diào)癌基因活性，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也可以下調(diào)抑癌基因活性，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。因此，尋找和研究與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA分子，對于探討肺癌的啟動機制、預防肺癌的轉(zhuǎn)移以及選擇合適的靶點進行干預均具有重要意義。

miR-598作為一個與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的miRNA分子，在結(jié)腸癌、文氏肉瘤、前列腺癌、食管癌等多種類型的腫瘤中呈低表達[6,8]，且其表達水平的高低與患者的預后呈正相關(guān)。不僅如此，miR-598還可以通過靶向調(diào)控JAG1基因抑制結(jié)腸癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲[6]。雖然miR-598在多種腫瘤中的抑癌功能已有闡述，但其介導肺癌細胞遷移侵襲的機制尚不明確。

本研究對37例NSCLC標本的miR-598表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)其在NSCLC組織中表達明顯降低，推測miR-598在NSCLC中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。為驗證此推斷，本研究通過miR-598 mimics及miR-598 inhibitors上調(diào)或抑制A549細胞中miR-598的表達，并通過劃痕實驗和Transwell實驗初步驗證了miR-598在NSCLC細胞中發(fā)揮著抑制腫瘤細胞遷移和侵襲的作用，同時運用生物信息學技術(shù)和雙熒光素酶實驗驗證了MSI2是其下游靶基因，進一步闡明了miR-598抑制NSCLC細胞遷移轉(zhuǎn)移是通過下調(diào)MSI2實現(xiàn)的。

MSI2蛋白屬于Musashi蛋白家族成員，不僅是干細胞和早期祖細胞的重要分子標志物，且與多種腫瘤的預后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13-14]。在胰腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤組織中MSI2高表達，并且其表達水平與腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[15-17]。在急性淋巴細胞性白血病中，MSI2表達水平與患者總體生存率呈負相關(guān)[18]。此外，MSI2是NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的一個重要調(diào)控因子，這可能與MSI2激活TGF-β信號通路、調(diào)控ERBB1/CLDN7/SMAD3等癌基因密切相關(guān)[19-20]。本研究中，上調(diào)MSI2表達水平后，NSCLC細胞遷移和侵襲能力顯著增強。

綜上所述，本研究從一個全新的方向闡述了NSCLC遷移和侵襲的機制，并為NSCLC的治療提供一個新的靶點。但MSI2調(diào)控NSCLC細胞遷移和侵襲是否與上述信號通路相關(guān)尚無法證實，需進一步研究驗證。