何建苗，趙華洲，王婷，邱嘯臣，翁劍峰，張心慧，曹志宇

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來逐漸上升，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。調(diào)查顯示，世界范圍內(nèi)每年新增120萬乳腺癌病例，且約有50萬患者死于本病[2]。雖然以手術(shù)、放療、化療等為主的綜合治療方案可有效改善乳腺癌患者的生活質(zhì)量，提高5年生存率，但仍不盡如人意[3]。因此，尋求更加安全、高效的乳腺癌治療方法是臨床亟待解決的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題。微RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與了人類基因組中30%左右基因的表達(dá)調(diào)控，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。近半數(shù)的miRNA位于與惡性腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域和(或)脆性位點(diǎn)，故其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著類似抑癌或致癌基因的作用[5]。miR-181a-5p是人類pre-miR-181a產(chǎn)生的剪接體之一。Li等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p在乳腺癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，提示其可能參與了乳腺癌的進(jìn)展過程。但miR-181a-5p對(duì)其下游靶基因的調(diào)控作用及其機(jī)制尚未完全明確。Kras屬于Ras基因家族，在所有Ras基因中，Kras與人類惡性腫瘤的關(guān)系最為密切，可發(fā)揮類似分子開關(guān)的作用，通過傳遞細(xì)胞信號(hào)引發(fā)惡性腫瘤細(xì)胞的一系列反饋，包括增殖、分化、侵襲及遷移等[7-8]。miR-181a-5p靶控Kras對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用已在非小細(xì)胞肺癌中得到證實(shí)[9]，但其是否可通過靶向Kras調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖及凋亡尚不明確。本研究檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231中miR-181a-5p和Kras的表達(dá)變化，并觀察了miR-181a-5p靶向Kras對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用，旨在為乳腺癌細(xì)胞的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、人乳腺細(xì)胞系HBL-100(美國ATCC細(xì)胞庫)；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-181a-5p mimics、陰性對(duì)照mimics、Kras 3'-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)質(zhì)粒(美國Invitrogen公司)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(美國BD公司)；MTT(美國Sigma公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual luciferase assays，美國Promega公司)；Kras單克隆抗體(美國Abcam公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物試劑有限公司)。miR-181a-5p引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞系MDAMB-231、人乳腺細(xì)胞系HBL-100，分別用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清+1%雙抗)重懸細(xì)胞，并置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)，每天換液1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 收集上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，采用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清+1%雙抗)調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/ml，然后接種于6孔板中，每孔1ml，共12孔。利用LipofectamineTM2000分別將300nmol/L miR-181a-5p mimics(miR-181a-5p組)、陰性對(duì)照mimics(陰性對(duì)照組)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，空白對(duì)照組僅加入等量PBS，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)培養(yǎng)24h。待轉(zhuǎn)染結(jié)束后，常規(guī)收集細(xì)胞待進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)miR-181a-5p的表達(dá)。參照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄至cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以SYBR Green法行RTPCR，以U6為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-181a-5p正義5'-CAAATTATTGTGGGTTGTC-3'，反義5'-TTATGGGTAGATGGGTGA-3'；U6正義5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，反義5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.2.4 Western blotting檢測(cè)MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中Kras蛋白的表達(dá) 采集各組細(xì)胞，常規(guī)提取蛋白，BCA法定量，取適量行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%封閉液4℃封閉4h，依次加入一抗(1:2000)、二抗(1:500)孵育，按ECL試劑盒說明書進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 收集各組細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染結(jié)束后置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)4h，300×g離心5min后棄上清，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)24h，300×g離心5min后棄上清，每孔加入100μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光度(OD)值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 收集各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，取195μl上述細(xì)胞懸液加入5μl Annexin-V-FITC，室溫孵育3min，然后加入10μl PI，室溫避光孵育10min，加入300μl緩沖液，混勻，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=(右上象限細(xì)胞+右下象限細(xì)胞)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)48h，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml，用0.01mol/L PBS洗滌1次，300×g離心5min后棄上清，加入500μl 70%冷乙醇(-20℃)后置于-4℃冰箱過夜培養(yǎng)，0.01mol/L PBS洗滌細(xì)胞3次，加入100μl RNase A，37℃水浴30min，加入400μl PI，吹打均勻，4℃避光孵育30min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液(10%胎牛血清+1%雙抗)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml，將野生型Kras 3'-UTR(Kras-wt)質(zhì)粒、突變型Kras 3'-UTR(Kras-Mut)與miR-181a-5p mimics或陰性對(duì)照mimics共轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后以海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中miR-181a-5p和Kras蛋白的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MDAMB-231細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá)明顯低于HBL-100細(xì)胞(P＜0.05)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞中Kras的蛋白表達(dá)明顯高于HBL-100細(xì)胞(P＜0.05，圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-181a-5p及Kras蛋白表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics相比，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics相比，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231細(xì)胞中Kras蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05，圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性(0.49±0.26)明顯低于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics組(1.51±0.11)及空白對(duì)照組(1.40±0.23)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 MDA-MB-231及HBL-100細(xì)胞中miR-181a-5p和Kras蛋白的表達(dá)Fig. 1 Expressions of miR-181a-5p and Kras proteins in MDA-MB-231 and HBL-100 cells

圖2 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-181a-5p和Kras蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the expressions of miR-181a-5p and Kras in MDA-MB-231 cells

2.4 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率(35.6%±4.4%)明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics組(13.4%±3.0%)及空白對(duì)照組(12.5%±2.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.5 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例(19.8%±3.4%)明顯增高，S期細(xì)胞比例(46.8%±3.3%)明顯降低，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics組(分別為13.4%±3.7%、55.9%±4.2%)及空白對(duì)照組(分別為13.8%±3.5%、57.3%±5.1%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the apoptosis of MDA-MB-231 cells

圖4 轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響Fig. 4 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the MDA-MB-231 cell cycle X axis shows DNA contents, Y axis shows cell number per unit volume

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics與Kras 3'-UTR野生質(zhì)粒后，MDA-MB-231細(xì)胞熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照mimics組明顯降低(P＜0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics與Kras 3'-UTR突變質(zhì)粒后，MDA-MB-231細(xì)胞熒光素酶活性無明顯改變(P＞0.05，圖5)。

圖5 MDA-MB-231細(xì)胞熒光酶素活性的變化Fig. 5 Changes of the activity of MDA-MB-231 cell fluorescent enzyme

3 討 論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率和病死率均呈逐年上升趨勢(shì)。研究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，對(duì)降低乳腺癌的發(fā)病率、提高患者生存率具有重要意義。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體多基因、多步驟的調(diào)節(jié)有關(guān)，因此，研究乳腺癌的癌基因和抑癌基因的相關(guān)信號(hào)通路及其影響因素是近年的熱點(diǎn)之一。

miR-181a-5p已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，但其在不同惡性腫瘤中的作用及機(jī)制不盡相同。Korhan等[10]研究證實(shí)，miR-181a-5p在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低或缺失，而過表達(dá)miR-181a-5p可抑制酪氨酸蛋白激酶受體c-Met活性，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖，提示miR-181a-5p在肝細(xì)胞癌中起著類似抑癌基因的作用。Chen等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p在胃癌組織中呈高表達(dá)，且其表達(dá)水平與胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)，而在體外上調(diào)miR-181a-5p的表達(dá)可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性，提示miR-181a-5p在胃癌中起著類似促癌基因的作用。而本研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-23中miR-181a-5的表達(dá)明顯低于HBL-100細(xì)胞(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics可明顯上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-181a-5p的表達(dá)，并對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖起到明顯抑制作用，同時(shí)可阻礙細(xì)胞有絲分裂，使細(xì)胞阻滯于G2/M期，提示miR-181a-5p在乳腺癌中發(fā)揮著類似抑癌基因的功能。

Kras基因是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的下游分子，而EGFR/Kras信號(hào)通路的激活是促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展的重要基礎(chǔ)[12-14]。大量臨床研究證實(shí)，Kras在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且其高表達(dá)與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)[15-18]，提示Kras在乳腺癌中起著促癌作用。Song等[19]通過體內(nèi)及體外研究證實(shí)，采用miR-200c靶向抑制Kras表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，提高移植瘤小鼠存活率，進(jìn)一步佐證了Kras在乳腺癌靶向治療中的重要地位。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中Kras蛋白的表達(dá)明顯高于HBL-100(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimics可使MDA-MB-231細(xì)胞中Kras蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示在MDA-MB-231細(xì)胞中，miR-181a-5p對(duì)Kras存在著某種負(fù)向調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，隨著Kras蛋白表達(dá)的下調(diào)，MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性明顯減弱，細(xì)胞凋亡比例明顯增加，且細(xì)胞周期亦發(fā)生明顯變化。雙熒光素酶活性檢測(cè)顯示，miR-181a-5p可與Kras 3'-UTR特異性結(jié)合，降低熒光酶活性，進(jìn)一步證實(shí)miR-181a-5p對(duì)Kras存在靶向作用，與既往研究一致[20]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中miR-181a-5p呈低表達(dá)，Kras呈高表達(dá)；miR-181a-5p可通過靶向抑制Kras表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控作用，是治療乳腺癌的潛在靶基因。