李彩弟 朱帥鵬 李萍 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院 青海西寧 8100166

前言

青藏高原地處亞歐大陸腹地，地勢(shì)高聳，被稱(chēng)為世界“第三極”，其平均海拔在4000m以上，氣候寒冷，年均溫度在0℃左右，空氣稀薄。青藏高原作為亞歐乃至世界水源涵養(yǎng)地和氣候調(diào)節(jié)器，其科學(xué)研究和生態(tài)屏障價(jià)值不言而喻，并日益引起社會(huì)的重視。然而長(zhǎng)期以來(lái)，過(guò)度放牧、草地退化現(xiàn)象的日益加劇以及片面追求工業(yè)發(fā)展嚴(yán)重破壞了青藏高原的生態(tài)環(huán)境，因此提高畜牧業(yè)發(fā)展水平成為了一項(xiàng)緊迫任務(wù)。

紫花苜蓿是一種深根性多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草，被譽(yù)為“牧草之王”，具有高蛋白質(zhì)、耐酸堿、耐貧瘠等特點(diǎn)，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展及遏制三化(沙化、退化、鹽漬化)等均具有重大作用。青大1號(hào)紫花苜蓿是由青海大學(xué)自主培育的新品系，通過(guò)多年的選育，已經(jīng)改變了在高寒地區(qū)不能安全越冬、返青率低的局面。

由于工業(yè)社會(huì)的的快速發(fā)展，如采礦、冶煉等，使水體、大氣以及土壤中鎘含量正在以每年數(shù)倍的速度增加。研究發(fā)現(xiàn)，鎘會(huì)通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，誘發(fā)各科疾病。Cd2+具有強(qiáng)植物毒性，引發(fā)諸如H2O2積累以及還原型谷胱甘肽發(fā)生瞬時(shí)損耗來(lái)抑制植物生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿粗蛋白的含量很容易受土壤中Cd2+的含量影響。鎘會(huì)破壞植物中的葉綠體結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量，引起植物體衰老。有研究表明，鎘脅迫能抑制鹽芥幼苗生物量的積累，減少葉綠素和胡蘿卜素的含量，降低葉片的光合放氧速率。并且研究發(fā)現(xiàn)，低濃度鎘能促進(jìn)這些植物的生長(zhǎng)，高濃度鎘處理會(huì)增大細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞膜受損。

G6PDH作為磷酸戊糖途徑中最重要的一個(gè)酶，嚴(yán)格調(diào)控著植物體內(nèi)反應(yīng)的速率及氧化還原反應(yīng)的平衡。因此，G6PDH在植物體內(nèi)有著不可替代的重要作用。陳超發(fā)現(xiàn)，G6PDH還具有抗氧化作用，能延長(zhǎng)紅豆杉細(xì)胞活力，提高紫杉醇產(chǎn)量。有國(guó)外的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，G6PDH是植物抗氧化過(guò)程中的一個(gè)抗性酶。植物G6PDH有2種形式，一種存在于細(xì)胞質(zhì)中，被稱(chēng)為胞質(zhì)型G6PDH，對(duì)氧化脅迫以及磷酸化無(wú)明顯反應(yīng)；另一種存在于細(xì)胞基質(zhì)中，被稱(chēng)為基質(zhì)型G6PDH，卻在對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)中被檢測(cè)到活性增強(qiáng)，這可能與G6PDH要行使不同調(diào)控功能有關(guān)。此外，在紫花苜宿受重金屬銅脅迫，大豆受干旱脅迫時(shí)，也發(fā)現(xiàn)G6PDH的活性有不同程度的提高。現(xiàn)有的結(jié)果表明G6PDH參與了對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答，探索G6PDH對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)，將有利于我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)G6PDH的功能，豐富植物的防御反應(yīng)機(jī)制。

本試驗(yàn)擬采用不同濃度CdCl2處理青大1號(hào)紫花苜蓿新品系幼苗，并測(cè)定其MDA及H2O2的含量和G6PDH活性等，初探G6PDH對(duì)鎘脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)的影響。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步研究紫花苜蓿對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：青大1號(hào)紫花苜蓿。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

選取籽粒飽滿(mǎn)、結(jié)構(gòu)完整的大小均一的種子，先用自來(lái)水沖洗10min，再用10%NaClO4消毒20min，然后用去離子水反復(fù)沖洗，最后將種子放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。待種子晾干后，接種至錐形瓶中。每一個(gè)錐形瓶處理種子20粒，同時(shí)設(shè)置3個(gè)平行樣，培養(yǎng)時(shí)間約為十天，其中萌發(fā)前約為三天，溫度為18—20度，無(wú)需光照。萌發(fā)后約為七天，溫度為24—26度，16小時(shí)光照與8小時(shí)黑暗交替進(jìn)行。

1.2.2 葉綠素、丙二醛、過(guò)氧化氫含量的測(cè)定

(1)選取其中生理狀態(tài)相同的植株移植于放有濾紙橋的新培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中CdCl2的濃度梯度為0，100μmol/L，200μmol/L，300μmol/L。其中每個(gè)濃度梯度為兩瓶，每瓶為9棵植株。并繼續(xù)在室溫條件下培養(yǎng)至5cm左右。

(2)測(cè)量其株高，根長(zhǎng)(包含側(cè)根數(shù)目)，鮮重(包含根重與莖重)，葉綠素含量并記錄數(shù)據(jù)。完成后樣品保留備用。

(3)測(cè)量其MDA，H2O2含量，重復(fù)三次，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 G6PDH含量的測(cè)定

(1)選取其中生理狀態(tài)相同的植株移植于放有濾紙橋的新培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液的體積均為50mL。并設(shè)置三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組，第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入100μmol/L的CdCl2，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入2.5mM/L的Na3PO4，第三個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入100μmol/L的CdCl2與2.5mM/L的Na3PO4。每瓶為9棵植株，并繼續(xù)在室溫條件下培養(yǎng)至5cm左右。

(2)測(cè)量其G6PDH含量，重復(fù)三次，并記錄數(shù)據(jù)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 紫花苜蓿葉片葉綠素的提取

(1)根據(jù)古川昭雄(1981)提出的無(wú)水乙醇法。取幼葉100～200mg，置于10mL離心管并加入5mL無(wú)水乙醇。

(2)置于黑暗處24h，取上清液4mL，測(cè)定其在665nm和649nm處的波長(zhǎng)。

(3)并計(jì)算

式中OD665、OD649分別為相應(yīng)波長(zhǎng)下的光密度值，V為提取液的體積，W為葉片鮮重，結(jié)果即為葉綠素含量。

1.3.2 丙二醛含量的測(cè)定

(1)參照Hodges等(1999)方法，略有改動(dòng)。取1g葉片加入3mL0.1%TCA并研磨勻漿，于3300rpm情況下離心20min，取上清液，完成后樣品保留備用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLTCA—TBA—HCl，置于離心管于95oC水浴30min,用冷水迅速冷卻，于3300rpm情況下離心5min，測(cè)定OD600，OD532，OD440nm處的光吸收值，并計(jì)算MDA濃度(μmol/L)=6.45×(OD532—OD600)—0.56×OD440，結(jié)果即為丙二醛含量。

1.3.3 H2O2含量的測(cè)定

(1)根據(jù)patterson等(1984)采用的TCA提取法[19]。取1g葉片加入3mL0.1%TCA并研磨勻漿，于3300rpm min—1下離心20min，取上清液，完成后樣品保留備用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLKI，置于黑暗90min，測(cè)定OD390。

(3)并計(jì)算H2O2濃度(μmol/L)=OD390/M，結(jié)果即為H2O2含量。

1.3.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法。取6只試管，從1—6分別編號(hào)，按照表1加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白液和蒸餾水，混合均勻。并向試管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G—250溶液，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

(2)根據(jù)測(cè)定的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)含量，縱坐標(biāo)為吸光度)，并求出標(biāo)準(zhǔn)線性方程。

(3)取粗酶提取液1.0mL，放入試管中，并加入5mL考馬斯亮藍(lán)G—250溶液，搖勻，放置2min后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)吸光度值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。

表1 考馬斯亮藍(lán)G—250標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制表Tab.1 Coomassie brilliant blue standard solution configuration

1.3.5 鎘脅迫下紫花苜蓿葉片G6PDH活性的測(cè)定

(1)根據(jù)Setsuko Wakao(2005)采取的提取法，略有改動(dòng)。取.0.5克葉片材料，用冰床研磨后，加入3mL配方[50mMHepes—Tris(pH7.8)，3mMMgCl2，1mMEDTA]研磨提取，勻漿液于4oC，12,000g離心20min，取上清即為粗酶提取液，并放置于冰床中。

(2)取 3mL配方加入 50μL15mMNADPNa2，50μL15mM6—PDHNa2，100μL粗酶提取液。空白對(duì)照用蒸餾水代替，啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)量在340nm處10min的間隔為30s的吸光值。

(3)選取10min內(nèi)吸光值變化比較均勻的數(shù)值作散點(diǎn)圖，添加趨勢(shì)線，得到其回歸方程。

(4)并計(jì)算G6PDH酶活=a/(M×t)，其中a為線性方程斜率，M為蛋白質(zhì)含量，t為反應(yīng)時(shí)間10min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin8.0，SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮重、株高、根長(zhǎng)在鎘脅迫下的變化

表2 不同濃度CdCl2對(duì)幼苗的影響Tab.2 Effects of different concentrations of CdCl2 on Seedlings

注：各小寫(xiě)字母表示在0.05水平上有顯著性差異

由表2可知：在CdCl2的脅迫濃度為100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1時(shí)，青大1號(hào)紫花苜蓿的鮮重、株高、根長(zhǎng)隨著CdCl2脅迫濃度的增加，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中鮮重分別下降了9.4%、26.5%、33.4%，株高分別下降7.7%、30.7%、40.3%，根長(zhǎng)分別下降 9.3%、33.3%、40.7%，并且與對(duì)照組相比差異顯著，說(shuō)明一定濃度的CdCl2能使植株個(gè)體變矮，生長(zhǎng)變緩，即對(duì)幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用。并且在200μmol L—1以后大1號(hào)紫花苜蓿的鮮重、株高、根長(zhǎng)的降低趨勢(shì)明顯變緩，說(shuō)明紫花苜蓿對(duì)鎘脅迫有一定的抵抗能力。

2.2 葉綠素含量在鎘脅迫下的變化

由圖1可知：在CdCl2的脅迫濃度為100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1時(shí)，紫花苜蓿幼苗中葉綠素含量隨著鎘濃度的的增加，出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。其中葉綠素a分別下降17.8%、25.7%、34.5%，葉綠素b分別下降15.4%、17.6%、33.0%， 總 葉 綠 素 含 量 分 別 下 降 14.0%、26.7%、50.6%這與在觀察過(guò)程中出現(xiàn)的隨著鎘濃度的增加，植株變矮，葉片數(shù)量減少，葉片枯黃等癥狀相吻合。并且與對(duì)照組相比均差異顯著。說(shuō)明CdCl2對(duì)葉綠素的含量有明顯的抑制作用。并且葉綠素b的含量的下降趨勢(shì)相比于總?cè)~綠素的含量的下降趨勢(shì)要明顯平緩。由此得出，CdCl2通過(guò)破壞葉綠素的結(jié)構(gòu)，減少葉綠素的含量來(lái)抑制紫花苜蓿幼苗的光合作用。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉綠素含量變化圖Fig.1 Changes of chlorophyll content in Alfalfa seedlings under different stress

2.3 MDA含量在鎘脅迫下的變化

圖2 不同處理下紫花苜蓿幼苗MDA含量變化圖Fig.2 Changes of MDA content in Alfalfa Seedlings unr ffrt t

據(jù)圖2所示：隨著CdCl2濃度的增加，紫花苜蓿幼苗中MDA含量升高，而且CdCl2脅迫濃度為 100μmol/L 時(shí)MDA含量為0.1958μmol/g，高于CdCl2脅迫濃度為0、200、300μmol/L時(shí)的 MDA含量為 0.1075、0.1582、0.1324μmol/g，與對(duì)照組相比均差異顯著。因此可以得出，CdCl2脅迫濃度為100μmol/L時(shí)，對(duì)植物的傷害程度更大。當(dāng)植物受到鎘脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基引發(fā)膜脂過(guò)氧化，它的積累對(duì)于細(xì)胞膜及細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)造成一定的傷害，所以丙二醛的含量可以反映植物在遭受脅迫時(shí)的傷害程度。

2.4 H2O2含量在鎘脅迫下的變化

據(jù)圖3所示：紫花苜蓿幼苗過(guò)氧化氫的含量隨著CdCl2濃度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。其含量分別為0.051、0.077、0.065、0.064μmol/g。說(shuō)明在逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除系統(tǒng)受到破壞，所積累的活性氧能引發(fā)膜脂過(guò)氧化作用。過(guò)氧化氫是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量反映植物遭受CdCl2傷害的程度。即在100μmol/L時(shí)紫花苜蓿幼苗體內(nèi)遭受的破壞最嚴(yán)重，隨著Cd2+質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，幼苗體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生了某種防御機(jī)制從而減緩了遭受的破壞。

圖3 不同處理下紫花苜蓿幼苗H2O2含量變化圖Fig.3 Changes of H2O2 content in Alfalfa Seedlings under different stress

>2.5 G6PDH活性在鎘脅迫和抑制劑交叉作用下下的變化

據(jù)圖5所示：各柱形圖的酶活性分別為0.0136U mg—1min—1，0.0183Umg—1min—1，0.0142Umg—1min—1 ，0.0112Umg—1min—1。即紫花苜蓿幼苗在CdCl2處理后G6PDH活性升高，說(shuō)明紫花苜蓿幼苗體內(nèi)對(duì)CdCl2造成的損傷產(chǎn)生了響應(yīng)而導(dǎo)致G6PDH活性升高，而用抑制劑Na3PO4處理后G6PDH活性降低了22.4%，且差異顯著，說(shuō)明Na3PO4對(duì)G6PDH活性產(chǎn)生了抑制作用而導(dǎo)致活性降低，說(shuō)明植物體內(nèi)具有一定的防御機(jī)制，并且這種防御機(jī)制能在一定程度上減輕外部脅迫造成的損害。

圖4 蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Protein standard curve

圖5 不同處理下紫花苜蓿幼苗G6PDH活性變化圖Fig.5 changes of G6PDH activity in Alfalfa Seedlings under different stress

3 討論

3.1 鎘脅迫下葉綠素的變化

葉綠素是光合作用中最重要的一類(lèi)色素，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細(xì)菌葉綠素，對(duì)光能的傳遞、吸收、轉(zhuǎn)換有重要作用。葉綠素很不穩(wěn)定，在光、酸、堿、氧化劑等作用下會(huì)分解。在鎘脅迫下，葉綠素膜受到破壞，葉綠素含量下降。在Cd2+在50—300μmol/L范圍內(nèi)，葉綠素含量急劇下降，導(dǎo)致葉片光合作用下降，生長(zhǎng)變緩，植株變矮，葉片枯黃，這可能是Cd2+抑制紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)的原因之一。

3.2 鎘脅迫下MDA、H2O2的變化

植物在Cd2+脅迫下膜脂過(guò)氧化作用進(jìn)程加快，植物體內(nèi)的活性氧含量提高，活性氧的代謝平衡被打破，從而啟動(dòng)膜脂脫脂作用，破壞膜的結(jié)構(gòu)和功能。重金屬是脂質(zhì)過(guò)氧化的誘變劑，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA、H2O2含量增加。本實(shí)驗(yàn)表明，在Cd2+在0—100μmol/L范圍內(nèi)的條件下，MDA、H2O2含量急劇上升，而在100—300μmol/L范圍內(nèi)MDA、H2O2含量緩慢下降，表明在100μmol/L濃度時(shí)紫花苜蓿幼苗細(xì)胞內(nèi)的功能結(jié)構(gòu)收到的破壞最為嚴(yán)重，即體內(nèi)收到的損害達(dá)到一定程度后才能啟動(dòng)防御機(jī)制。

3.3 鎘脅迫下G6PDH的變化

在鎘脅迫下，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，從而引起細(xì)胞膜通透性增加，而膜通透性變化越大，表示細(xì)胞受傷的程度越嚴(yán)重。紫花苜蓿幼苗正是通過(guò)提高G6PDH活性來(lái)抵抗Cd2+的脅迫。本實(shí)驗(yàn)中CdCl2處理后的植株G6PDH活性最高，雙重處理后的植株G6PDH活性次之，而抑制劑Na3PO4處理后的G6PDH活性最低，表明一定濃度的Cd2+對(duì)G6PDH活性有促進(jìn)作用，而抑制劑Na3PO4對(duì)G6PDH活性有明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

通過(guò)紫花苜蓿幼苗在抑制劑和鎘脅迫下其MDA、H2O2、G6PDH活性的變化研究，結(jié)果表明：MDA、H2O2含量隨著鎘脅迫的濃度的增加出現(xiàn)升先降后升的變化規(guī)律，而且抑制劑Na3PO4對(duì)G6PDH活性具有明顯的抑制作用。這表明紫花苜蓿幼苗具有一定的抗重金屬脅迫性，能夠在一定濃度的Cd2+條件下正常生長(zhǎng)，并且紫花苜蓿幼苗具有一定的抗脅迫機(jī)制。并且說(shuō)明G6PDH抑制劑會(huì)加劇苜蓿植株受到重金屬脅迫后所造成的氧化傷害的程度，表明了苜蓿幼苗通過(guò)增加G6PDH的活性來(lái)抵抗重金屬脅迫環(huán)境，避免植株受到嚴(yán)重的氧化傷害。因此G6PDH抑制劑會(huì)加劇植株遭受到重金屬脅迫的氧化傷害程度，從而證實(shí)了G6PDH參與抗脅迫性的調(diào)節(jié)。