黃蕓，翁俊美，孟一迪，徐秋梅，聶大安，李子進(jìn)，劉杰，李景東，姚東曉

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院：1老年病科，2心血管內(nèi)科，3神經(jīng)外科，武漢 430022)

冠心病心肌缺血和急性心肌梗死可導(dǎo)致心臟重構(gòu)、心力衰竭和心律失常[1,2]。心肌再灌注治療是最有效的治療方法之一，但有導(dǎo)致再灌注損傷的不利作用[3,4]。缺血預(yù)適應(yīng)可通過(guò)再灌注損傷補(bǔ)救激酶激活等機(jī)制，減輕心肌再灌注損傷[5,6]。內(nèi)向性整流性鉀電流(inward rectifier potassium current，IK1)在心肌缺血時(shí)下調(diào)，并在心肌細(xì)胞缺血預(yù)適應(yīng)模型中起著重要作用[7,8]。長(zhǎng)期以來(lái)，因無(wú)特異性的心臟IK1抑制劑，對(duì)其下調(diào)與缺血預(yù)適應(yīng)和再灌注損傷的關(guān)系尚未闡明。為此，本研究選用轉(zhuǎn)基因抑制心臟IK1小鼠，建立心臟缺血預(yù)適應(yīng)模型，研究特異性抑制心臟IK1在缺血預(yù)適應(yīng)時(shí)是否具有減輕再灌注損傷的作用及其機(jī)制，可望為開(kāi)發(fā)新一代特異性心臟IK1抑制手段治療冠心病心肌缺血提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與液體配制

轉(zhuǎn)基因心臟IK1抑制小鼠(Kir2.1-AAA)由美國(guó)Michigan大學(xué)Anatoli N. Lopatin贈(zèng)送，小鼠飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)(無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，Specific Pathogen Free)環(huán)境中。Kir2.1-AAA轉(zhuǎn)基因鑒定引物序列：正向?yàn)?′-CTGTGTCGACATCCGCTGGAGGTGG-3，反向?yàn)?′-CCCACTCTCCACATCAAGCAGAGTT-3′，其聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物為420 bp，將此條帶測(cè)序，陽(yáng)性者為GYG突變?yōu)锳AA。實(shí)驗(yàn)取3～6個(gè)月齡小鼠，體質(zhì)量18～25 g，分為觀察組(n=9)和對(duì)照組(n=12)，雌雄比例相同。

Langendorff離體心臟灌流液：KHB(Krebs-Henseleit bicarbonate)溶液配制1 L需要氯化鈉6.89 g、氯化鉀0.35 g、碳酸氫鈉2.1 g、硫酸鎂0.144 g、磷酸二氫鉀0.144 g、氯化鈣0.368 g、乙二胺四乙酸鈉(EDTA Na)0.416 g、葡萄糖2.702 g、丙酮酸鹽2.703 g，濃鹽酸調(diào)整pH=7.35。1%氯代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)磷酸緩沖液：每100 ml含1 g TTC、88 mmol/L Na2HPO4和1.8 mmol/L NaH2PO4，pH=7.8。

1.2 方法

1.2.1 體表心電圖 麻醉小鼠后，以溫控小電熱毯保持其體溫在36℃～37℃，利用RM6240數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(成都儀器公司)持續(xù)記錄基礎(chǔ)狀態(tài)下小鼠心電圖5 min，測(cè)量心率(heart rate，HR)、PR間期和QRS間期，并監(jiān)測(cè)心律失常發(fā)生情況。

1.2.2 心臟缺血預(yù)適應(yīng)模型的建立 用1%戊苯巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，從主動(dòng)脈遠(yuǎn)端分離心臟并連接至Langendroff灌流裝置，以95%O2和5%CO2的混合氣體持續(xù)沖入(37.0±0.5)℃的KHB液，先穩(wěn)定10 min，缺血2 min，灌注5 min，2個(gè)循環(huán)，然后全心缺血20 min，再灌注45 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取心臟-80℃保存。

1.2.3 心律失常檢測(cè) 將3個(gè)Ag+/AgCl電極分別置于心臟心尖部和左右兩側(cè)形成 Einthoven三角，記錄離體心臟心電圖。心律失常評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)心律失常(0分)，房早或室早(1分)，室上速或成對(duì)室性早搏或T波電交替(2分)，室早呈三聯(lián)率或呈短陣≥3個(gè)但≤10個(gè)(3分)，持續(xù)室速(定義為室早≥10個(gè))或多行性室速或尖端扭轉(zhuǎn)性室速(4分)[9]。

1.2.4 心肌梗死面積測(cè)定 取冷凍心臟，橫切成約2 mm薄片5層，置入1% TTC磷酸緩沖液(pH 7.4)中37℃孵育20 min。梗死區(qū)呈灰白色，非梗死區(qū)呈深紅色。拍照后，以ImageJ2x軟件測(cè)定心肌梗死面積。

1.2.5 Tunel凋亡檢測(cè) 灌流結(jié)束后將心臟置入4%的甲醛磷酸鹽緩沖液，固定48 h，石蠟包埋心臟組織，切片，采用Roche的Insitucell death定量藥盒檢測(cè)。凋亡指數(shù)(‰)=凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)/正常心肌細(xì)胞核數(shù)×1000‰。

1.2.6 Western blotting 取心臟左心室，檢測(cè)樣本濃度，15 μg/孔上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶封閉，Ⅰ抗的稀釋度為1∶1000，4℃孵育過(guò)夜。相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育2 h后，暗室曝光。蛋白條帶相對(duì)濃度用Lab Image軟件測(cè)定。Ⅱ抗包括p-AKT、AKT、p-GSK3β和GSK3β。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠鑒定及基因檢測(cè)結(jié)果

Kir2.1-AAA轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性與陰性PCR片段均顯示420 bp條帶(圖1A)。陰性者顯示KCNJ2孔道區(qū)為GGCTATGGT(編碼相應(yīng)氨基酸為GYG)，陽(yáng)性為GCCGCTGCT(AAA)，見(jiàn)圖1B。

2.2 基礎(chǔ)狀態(tài)下2組小鼠的體表心電圖

基礎(chǔ)狀態(tài)下觀察組(n=9)和對(duì)照組(n=12)的HR分別為(446.4±35.9)和(463.6±46.8)次/min，PR間期分別為(53.58±12.32)和(52.15±13.23)ms，QRS間期分別為(22.95±17.33)和(21.5±16.67)ms，2組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 Kir2.1-AAA對(duì)小鼠心律失常的影響

與對(duì)照組(n=12)相比，觀察組(n=9)心律失常評(píng)分分值顯著降低[(3.50±0.67)vs(7.42±0.70)分，P<0.01]，提示抑制 IK1可減少缺血致心律失常的發(fā)生。

2.4 Kir2.1-AAA對(duì)小鼠心肌梗死面積的影響

與對(duì)照組(n=10)相比，觀察組(n=8)小鼠心肌梗死面積/左室面積的比值顯著減少[(0.25±0.04)%vs(0.38±0.02)%，P<0.05]。

2.5 Kir2.1-AAA對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組(n=7)相比，觀察組(n=8)小鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低[(202±93)‰vs(822.5±97.5)‰，P<0.001]，提示特異性抑制IK1具有減緩心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡的作用。

2.6 Kir2.1-AAA對(duì)再灌注損傷補(bǔ)救激酶信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響

GSK3相對(duì)表達(dá)量在觀察組和對(duì)照組中分別為(0.79±0.11)和(0.77±0.15)，2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但觀察組磷酸化糖原合成酶激酶3(phosphorylated glycogensynthaseldnase 3，p-GSK3)相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組[(1.41±0.16vs(0.77±0.05)，P<0.05]，提示p-GSK3可能介導(dǎo)了Kir2.1-AAA對(duì)缺血再灌注心臟的保護(hù)作用(圖2A)。此外，觀察組中無(wú)論是AKT[(1.84±0.20)vs(0.81±0.14)]還是P-AKT[(1.87±0.27)vs(1.08±0.22)]的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，提示AKT和P-AKT均可能介導(dǎo)了抑制IK1對(duì)缺血再灌注心臟的保護(hù)作用(圖2B)。

圖2 Kir2.1-AAA對(duì)RISK信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

冠心病及其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命與健康[2]，IK1在冠心病心力衰竭時(shí)下調(diào)，在心臟重構(gòu)過(guò)程中起著重要作用[10,11]。近年來(lái)，隨著溶栓和介入技術(shù)的廣泛應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷越來(lái)越受到關(guān)注，缺血預(yù)適應(yīng)可改善心肌缺血再灌注損傷，但其機(jī)制尚待深入研究[6]。本研究采用轉(zhuǎn)基因特異性抑制IK1小鼠建立缺血預(yù)適應(yīng)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性抑制IK1可以改善缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，減少心律失常發(fā)生以及心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積。

本研究結(jié)果表明，IK1抑制小鼠在離體心臟缺血再灌注模型缺血預(yù)適應(yīng)后，其心律失常明顯少于對(duì)照組小鼠。理論上講，特異性抑制IK1既可能抑制也可能促進(jìn)心律失常的發(fā)生，因?yàn)橐种艻K1會(huì)降低靜息膜電位的穩(wěn)定性，促進(jìn)除極化，使自律性增加[12]。但抑制IK1又可均一地延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)間和不應(yīng)期，降低心室復(fù)極離散度而防止折返形成，延緩異常興奮的傳播，從而具有抗心律失常作用[13]。高血壓性心肌肥大、心肌病及各種原因所致的心力衰竭均伴有IK1下調(diào)[14]，過(guò)度表達(dá)IK1的小鼠表現(xiàn)為心律失常及心臟肥大等異常[15]。本研究結(jié)果也證實(shí)了均一特異性抑制IK1具有抗心律失常的作用。

本研究表明，轉(zhuǎn)基因抑制IK1可減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡。研究表明，缺血預(yù)適應(yīng)會(huì)引起再灌注損傷補(bǔ)救激酶的激活，包括PI3K/Akt/GSK3β和Erk1/2通路的活化，再進(jìn)一步激活或抑制下游信號(hào)分子包括酶代謝、凋亡分子等，抑制有害的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換，從而保護(hù)心肌[16]。本研究結(jié)果顯示，Akt蛋白與GSK3β蛋白在觀察組(IK1抑制)的表達(dá)量高于對(duì)照組，提示抑制IK1可能加大激活這些信號(hào)傳導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。值得提出的是，在文獻(xiàn)[17]報(bào)道的與本研究相同的模型中，缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)野生型小鼠(本研究中的對(duì)照組)心臟本身即具有保護(hù)作用，因而本研究發(fā)現(xiàn)的特異性抑制IK1帶來(lái)的有益作用至少部分是額外的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)特異性抑制IK1可保護(hù)缺血心臟。在離體心臟缺血再灌注模型缺血預(yù)適應(yīng)后，轉(zhuǎn)基因特異性抑制IK1小鼠相比野生型小鼠在抗心律失常方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且可減少心肌梗死范圍、抗細(xì)胞凋亡，但對(duì)其具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究可望為未來(lái)治療缺血性心臟病提供新的理論依據(jù)。