周開梅，袁森輔，沈祥林

宜賓市第一人民醫(yī)院病理科，四川 宜賓644000

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年增高，并呈年輕化趨勢[1-2]。內(nèi)分泌治療、化療、放療及手術(shù)治療是臨床治療乳腺癌的常用手段[3]。乳腺腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者治療及預(yù)后的主要因素。因此，了解乳腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，預(yù)測其早期診斷的新指標(biāo)，對乳腺癌的預(yù)防和治療具有重大意義[4]。趨化因子受體 9（chemokine receptor 9，CCR9）可以通過激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）途徑，上調(diào)腫瘤細(xì)胞抗凋亡蛋白，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[5-6]。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）能增加基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性，促進(jìn)腫瘤侵襲淋巴結(jié)，發(fā)生轉(zhuǎn)移[7-8]。CCR9和COX-2在多種腫瘤中均高表達(dá)，但在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性少有報(bào)道。為尋找最佳乳腺癌診治標(biāo)志物，本研究對乳腺癌組織中CCR9和COX-2的表達(dá)情況進(jìn)行分析，旨在探討CCR9和COX-2表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系及其在乳腺癌發(fā)展過程的作用，為早期診斷乳腺癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2014年4月至2016年4月宜賓市第一人民醫(yī)院收治的行手術(shù)切除的乳腺癌患者的病歷資料，并收集其于醫(yī)院存檔的乳腺標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為乳腺癌，且均為女性；③術(shù)前未行化療、放療等治療；④無其他原發(fā)性惡性腫瘤；⑤術(shù)后標(biāo)本保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長期服用糖皮質(zhì)激素或非甾體類抗炎藥物者；②患有嚴(yán)重心、肝、腎等原發(fā)性疾病者；③妊娠期或者哺乳期婦女。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入乳腺癌患者96例，其中取患者的乳腺癌組織標(biāo)本共96例，取對應(yīng)的癌旁（距離腫瘤邊緣2 cm）正常組織標(biāo)本共35例。96例乳腺癌患者的年齡為28～67歲，平均年齡（43.63±11.90）歲；腫瘤直徑：≤2 cm 25例，＞2 cm 71例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期51例，Ⅲ期27例；雌激素受體（estrogen receptor，ER）：陽性37例，陰性59例；孕激素受體（progestogen receptor，PR）：陽性33例，陰性63例。

1.2 檢測方法

采用免疫組化SP法染色，檢測乳腺癌組織和癌旁正常組織中CCR9、COX-2蛋白的表達(dá)。兔抗人CCR9和COX-2單克隆抗體及SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，操作嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化結(jié)果判定：以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕褐色顆粒為CCR9蛋白陽性表達(dá)；以細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為COX-2蛋白陽性表達(dá)。每個(gè)標(biāo)本選取5～6個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行染色強(qiáng)度評分：0分，無染色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細(xì)胞所占比例評分：0分，無陽性細(xì)胞或陽性細(xì)胞所占比例＜5%；1分，陽性細(xì)胞所占比例為5%～25%；2分，陽性細(xì)胞所占比例為25%～50%；3分，陽性細(xì)胞所占比例≥50%。兩項(xiàng)評分相加，總分＜3分為陰性；3～6分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中CCR 9、COX- 2蛋白表達(dá)情況的比較

免疫組化染色結(jié)果顯示：CCR9蛋白在細(xì)胞膜上呈棕褐色顆?；驈浬⒌郊?xì)胞質(zhì)著色；COX-2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色顆粒（圖1）。乳腺癌組織中CCR9、COX-2蛋白的陽性表達(dá)率分別為63.5%（61/96）、52.1%（50/96），均分別高于癌旁正常組織的11.4%（4/35）、17.1%（6/35），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 CCR 9、COX- 2蛋白在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×100）

2.2 乳腺癌組織中CCR 9、COX- 2蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CCR9和COX-2蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.486，P＜0.01）。（表1）

2.3 CCR 9和COX- 2蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

低分化、腫瘤直徑＞2 cm、TNM分期為Ⅲ期及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的乳腺癌組織中CCR9和COX-2蛋白的陽性表達(dá)率均分別高于中-高分化、腫瘤直徑≤2 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ER陰性、PR陰性的乳腺癌患者的乳腺癌組織中CCR9和COX-2蛋白的陽性表達(dá)率均分別高于ER陽性、PR陽性的乳腺癌患者，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表1 乳腺癌組織中CCR 9和COX- 2蛋白表達(dá)的關(guān)系（ n=96）

表2 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中CCR 9和COX- 2蛋白的表達(dá)情況（ n=96）

3 討論

乳腺癌是女性常見的一種惡性腫瘤，其惡性程度較高，具有高轉(zhuǎn)移性，嚴(yán)重影響著女性患者的生活質(zhì)量[9]。乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制極其復(fù)雜，其需要先降解細(xì)胞外基質(zhì)，為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供一條通道，然后再離開原發(fā)部位經(jīng)由通道侵入血管，黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞等，進(jìn)而向鄰近或遠(yuǎn)處組織侵襲[10-11]。乳腺癌的臨床治療目標(biāo)在于早預(yù)防、早診斷、早治療，從而改善患者的癥狀，提高患者健康水平[12]。因此，了解乳腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，有助于發(fā)現(xiàn)乳腺癌早期診斷的參考指標(biāo)[13]。CCR9和COX-2在多種人類惡性腫瘤中過表達(dá)，本研究主要探討乳腺癌組織中CCR9和COX-2蛋白的表達(dá)情況及其與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系。

多項(xiàng)研究報(bào)道，趨化因子受體及其配體在腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管形成等方面發(fā)揮著重要作用[14]。CCR9是CC族趨化因子受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其唯一配體為CCL25，CCL25/CCR9與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[15]。相關(guān)研究表明，CCR9在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，乳腺癌組織中CCR9的陽性表達(dá)率較高，并且CCR9的陽性表達(dá)與乳腺癌患者的組織分化程度、腫瘤直徑、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。提示CCR9可能是乳腺癌發(fā)生過程的調(diào)控因子，可誘導(dǎo)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分析其原因可能為，MMP-2和MMP-9能特異性降解人體細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，是臨床診斷乳腺癌患者分期和預(yù)后的重要指標(biāo)[17]。乳腺癌組織CCR9的高度表達(dá)能誘導(dǎo)PI3K/AKT途徑的激活，促進(jìn)MMP-2和MMP-9蛋白的合成和表達(dá)，從而有效加快乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。另外，CCL25與CCR9受體結(jié)合后，不僅能下調(diào)凋亡蛋白caspase 3表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡；還能通過PI3K/AKT途徑上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的抗凋亡蛋白，如ERK1/2和GSK-3β的表達(dá)，從而增強(qiáng)乳腺腫瘤的存活能力[18]。隨著乳腺癌細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，CCR9蛋白表達(dá)量逐漸增加，能有效誘導(dǎo)PI3K/AKT途徑的活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，在乳腺癌發(fā)展中扮演著重要的角色。

另有研究表明，COX涉及人類多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。COX-2是合成前列腺素（prostaglandin，PG）的重要限速酶，正常機(jī)體中，COX-2處于低表達(dá)水平，在多數(shù)組織中難以檢測到COX-2，但在腫瘤組織中過度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，乳腺癌組織中COX-2的陽性表達(dá)率較高，并且COX-2的陽性表達(dá)與乳腺癌患者的分化程度、腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。提示COX-2可能在乳腺癌的發(fā)生過程中起著重要作用。分析其原因可能為，COX-2能通過誘導(dǎo)PG合成，促進(jìn)乳腺癌血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。另外，COX-2也能夠誘導(dǎo)MMP-9合成，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。以上研究表明，COX-2的陽性表達(dá)與乳腺癌血管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)，可為臨床乳腺癌的早期診斷提供依據(jù)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中CCR9和COX-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。COX-2一般情況下處于靜息狀態(tài)，在受到生長因子、內(nèi)毒素、致炎因子等一定刺激后，才會在炎性反應(yīng)和致癌過程中發(fā)揮重要作用[21]。CCR9是趨化因子受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體，與配體結(jié)合后能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞聚集到炎癥局部組織，加重炎性反應(yīng)；還能刺激血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的成熟[22]；揭示CCR9可能會通過某種途徑誘導(dǎo)COX-2的合成。兩者均可能參與乳腺癌的發(fā)展。

綜上所述，乳腺癌組織中CCR9與COX-2表達(dá)呈正相關(guān)，兩者能協(xié)同促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展。聯(lián)合檢測乳腺癌組織中CCR9與COX-2蛋白的表達(dá)情況，可為有效判斷乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供參考指標(biāo)，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。