王亞飛，宋小天，宋長亮，張磊，萬良剛，杜雪菲

1邯鄲市中心醫(yī)院腫瘤科，河北 邯鄲056000

2河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫教研室，河北 邯鄲056000

3冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院骨科，河北 邯鄲056000

在中國，肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，其中，病死率位居惡性腫瘤的首位。根據(jù)組織學特征和臨床特點，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，后者占肺癌的85%以上[1]。早期肺癌患者多無自覺癥狀，大多數(shù)患者確診時已屬于晚期，錯失了最佳的手術治療時機，故放療和化療是肺癌的主要治療手段。術后放化療能夠有效減少肺癌的復發(fā)和轉移，但部分患者常常在一線治療后對化療藥物表現(xiàn)出較低的化療敏感度，如何增強化療藥物的敏感度是化療面臨的重要難題。化療是利用化學藥物殺死腫瘤細胞，從而抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的目的。紫杉醇是從紅豆杉科植物中提取的一種抗腫瘤二萜類化合物，是一種細胞周期特異性藥物，在乳腺癌和肺癌等多種腫瘤的化療中得到廣泛應用，但患者常常出現(xiàn)抗藥性和耐藥性。如何實現(xiàn)紫杉醇在治療過程中增敏、增效的作用是臨床亟需解決的問題。微小RNA（miroRNA，miRNA）是一類具有組織特異性、高度保守性和時序性等特征的小分子非編碼小RNA，在腫瘤基因表達的調控過程中具有重要的作用。miRNA-200家族是miRNA的重要組成部分，是近年來研究的熱點。miRNA-200a作為miRNA-200家族中的重要一員，參與肝癌、乳腺癌和子宮內膜癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡等過程[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200a在非小細胞肺癌組織及細胞中低表達，上調其表達后能夠抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等[5-7]。但目前未見關于miRNA-200a是否參與肺癌治療過程中紫杉醇耐藥機制的相關研究，本研究以體外實驗的方式采用脂質體法干擾miRNA-200a在非小細胞肺癌細胞中的表達，觀察其對非小細胞肺癌細胞紫杉醇化療敏感性的影響，并探討其可能的作用機制，為逆轉肺癌化療耐藥性提供新的方向和理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

正常人肺上皮16HBE細胞株和人肺癌A549細胞株均購自美國ATCC公司，miRNA-200a模擬物（miRNA-200a mimics）、miRNA-200a陰性對照（mimics NC）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物均購自上海吉瑪公司，RNA逆轉錄試劑盒、熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒和熒光定量PCR儀均購自美國TaKaRa公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、LipofectamineTM2000和電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑均購自美國Invitrogen公司，紫杉醇（純度99.5%）購自西安天豐生物科技有限公司，噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）檢測分析試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白濃度檢測試劑盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和Trizol試劑均購自上海碧云天生物技術有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）均購自美國 Sigma公司，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體和辣根過氧化物酶標記的IgG-HRP二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，酶標儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將復蘇后的正常人肺上皮16HBE細胞和肺癌A549細胞接種于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)基上，置于5%CO2、95%濕度和37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔1天換液1次，待細胞幾乎鋪滿整個培養(yǎng)瓶時，以0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。收集對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測采用qRT-PCR法檢測miRNA-200a的相對表達量。收集對數(shù)生長期的正常人肺上皮16HBE細胞和A549細胞，采用Trizol法提取兩種細胞中的總RNA，采用紫外分光光度計檢測所提取的總RNA濃度及純度。采用RNA逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)miRNA-200a特異性引物、內參U6引物及相應的組分配成20 μl的反應體系（Master mix10 μl、上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl，ddH2O 6.4 μl），以95℃ 5 min（1個循環(huán)）、95℃ 30 s（35個循環(huán)）、58℃ 30 s（35個循環(huán)）、72℃ 2 min（35個循環(huán)）和72℃6 min（1個循環(huán)）的反應條件進行PCR擴增。以U6為內參。應用2-△△Ct法計算miRNA-200a的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.3 細胞轉染及分組取對數(shù)生長期的A549細胞，將其分為空白對照組、mimics NC組和miRNA-200a mimics組，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書的實驗步驟將miRNA-200a模擬物和轉染試劑混合物轉至miRNA-200a mimics組細胞中，miRNA-200a陰性對照和轉染試劑混合物轉至mimics NC組細胞中，空白對照組中只加入轉染試劑。其中，miRNA-200a模擬物和miRNA-200a陰性對照的濃度均為25 μmol/L。轉染48 h后，按照1.2.2中的步驟檢測各組細胞的轉染效果。

1.2.4 MTT法檢測收集對數(shù)生長期的A549細胞，調整細胞濃度為105/ml，以每孔1 ml接種至96孔細胞培養(yǎng)板上。將其隨機分為紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組。其中，miRNA-200a+紫杉醇組細胞先以脂質體法轉染miRNA-200a模擬物，紫杉醇組細胞不進行轉染，轉染6 h后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。當細胞融合度達到80%左右時，兩組細胞分別加入終濃度為2、4、8、16、32 nmol/L的紫杉醇溶液，處理反應24 h后，加入濃度為5 g/L的MTT溶液10 μl，避光孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入DMSO溶解結晶物后，采用全自動酶標儀于490 nm處檢測兩組細胞的吸光度值，計算兩組細胞相應濃度的細胞增殖抑制率，并計算出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。其中，每個濃度重復3次。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測取對數(shù)生長期的A549細胞，制成細胞懸液后，以105/ml細胞接種至96孔板上，將其隨機分為空白對照組、miRNA-200a mimics組、紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組。按照1.2.3中的實驗方法轉染miRNA-200a模擬物至miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細胞，空白對照組和紫杉醇組細胞不進行處理，4組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以8 nmol/L的紫杉醇處理紫杉醇組和miRNA-200a+紫杉醇組細胞，處理24 h后，收集各組細胞，以RIPA提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測其純度及濃度。取變性后的50 μg樣品蛋白，注入SDSPAGE凝膠中進行電泳分離，轉至PVDF膜上后，置于5%的脫脂奶粉封閉液中處理1 h，加入稀釋濃度為1∶1000的β-catenin抗體和GAPDH抗體，4℃下孵育過夜。次日，洗膜后加入稀釋濃度為1∶2000的IgG-HRP二抗，于37℃下孵育2 h，以ECL顯色。以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-200 a在非小細胞肺癌 A549細胞中的相對表達量

非小細胞肺癌A549細胞中miRNA-200a的相對表達量為（0.26±0.08），明顯低于正常人肺上皮16HBE細胞的（1.02±0.03），差異有統(tǒng)計學意義（t=15.407，P＜0.01）。

2.2 轉染后 A549細胞中miRNA-200 a的相對表達量

轉染48 h后，空白對照組、mimics NC組、miRNA-200a mimics組細胞中miRNA-200a的相對表達量分別為（1.06±0.12）、（1.18±0.25）和（5.02±0.16），3組細胞中miRNA-200a的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=445.487，P＜0.01）。mimics NC組細胞中miRNA-200a的相對表達量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.795，P＞0.05）；miRNA-200a mimics組細胞中miRNA-200a的相對表達量明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=26.239，P＜0.01）。miRNA-200a mimics組細胞中miRNA-200a的相對表達量明顯高于mimics NC組，差異有統(tǒng)計學意義（t=22.408，P＜0.01）。

2.3 miRNA-200 a對紫杉醇化療藥物敏感度的影響

MTT法檢測結果顯示，隨著紫杉醇濃度的增加，A549細胞受到的增殖抑制作用明顯增強，且呈一定的濃度依賴性；與紫杉醇組相比，轉染miRNA-200a mimics后，隨著紫杉醇濃度的增加，A549細胞受到的增殖抑制作用增強（t=4.279、5.968、4.107、3.801、2.825，P＜ 0.05）。miRNA-200a+紫杉醇組的IC50為5.90 nmol/L，紫杉醇組的IC50為 9.57 nmol/L。（表1）

表1 不同濃度紫杉醇溶液處理后 A549細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度紫杉醇溶液處理后 A549細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：*與紫杉醇組比較，P＜0.05

組別紫杉醇組miRNA-200a+紫杉醇組紫杉醇濃度（nmol/L）2 18.2±1.4 25.7±2.6*48 23.1±3.0 37.3±2.8*43.8±5.2 58.7±3.5*16 62.4±3.8 75.8±4.9*32 71.2±5.1 84.7±6.2*

2.4 轉染聯(lián)合紫杉醇對Wnt/ β-catenin信號通路相關的 β-catenin蛋白的影響

空白對照組、紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細胞中β-catenin蛋白的相對表達量分別（0.78±0.03）、（0.62±0.05）、（0.48±0.05）和（0.25±0.04），4組細胞中β-catenin蛋白的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=73.12，P＜0.01）。與空白對照組相比，紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細胞中β-catenin蛋白的相對表達量均明顯降低（t=4.526、8.485、14.991，P＜0.01）；與紫杉醇組相比，miRNA-200a+紫杉醇組細胞中β-catenin蛋白的相對表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.465，P＜0.01）。（圖1）

圖1 轉染聯(lián)合紫杉醇處理后 A549細胞β -catenin蛋白的表達情況

3 討論

miRNA-200家族通過抑制上皮-間質轉化在腫瘤轉移的過程中扮演著重要的角色。miRNA-200a是miRNA-200家族的重要成員，在多種腫瘤組織中表達水平較低，以抑癌基因的角色參與腫瘤細胞的增殖、凋亡等生理過程[8]。有研究表明，miRNA-200a還參與多種腫瘤化療藥物的耐藥過程，如Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，過表達miRNA-200a可能通過調控與耐藥相關的ABC家族基因的表達，增加卵巢腫瘤細胞對紫杉醇的敏感度；沈阿靈等[10]研究發(fā)現(xiàn)，上調miRNA-200a表達可逆轉大腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性。目前，關于miRNA-200a對非小細胞肺癌化療藥物敏感度的研究較少，本實驗通過脂質體法上調肺癌A549細胞中miRNA-200a的表達后，加入紫杉醇藥物進行處理，采用MTT法檢測miRNA-200a對紫杉醇處理的A549細胞的增殖抑制情況的影響。結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-200a+紫杉醇組細胞的IC50為5.90 nmol/L，紫杉醇組的IC50為9.57 nmol/L，表明上調miRNA-200a表達能夠增強A549細胞對紫杉醇化療藥物的敏感度。

Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt通路，是機體正常生長發(fā)育的重要途徑。Wnt/β-catenin信號通路的異常表達與非小細胞肺癌細胞增殖、分化及凋亡等過程密切相關[11-13]。β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路調控的核心因子，是Wnt/βcatenin通路激活的重要標志。有研究表明，紫杉醇可調控多種腫瘤細胞中的Wnt/β-catenin信號通路，如Fu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌對化療藥物紫杉醇的治療可產(chǎn)生耐藥性，這種耐藥性與Wnt/β-catenin信號通路有關，在人卵巢癌細胞株A2780和SKOV3中，紫杉醇能夠誘導β-catenin表達；涂雪松等[15]研究指出紫杉醇可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制人鼻咽癌細胞株HONE1的增殖，并促進其凋亡。侯峰強等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇通過抑制膽管癌QBC939細胞內β-catenin蛋白的表達，阻斷Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路中βcatenin蛋白的表達還受miRNA-200a的調控。Su等[17]指出，miRNA-200a通過與β-catenin相互作用，可阻斷胃癌SGC790細胞和膠質瘤U251細胞中的Wnt/β-catenin信號通路。為了進一步探討過表達miRNA-200a能夠增強A549細胞對紫杉醇化療藥物敏感度的作用機制，本研究上調肺癌A549細胞中miRNA-200a的表達后，加入紫杉醇藥物進行處理，并采用Western blot檢測肺癌A549細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin的表達，結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，紫杉醇組、miRNA-200a mimics組和miRNA-200a+紫杉醇組細胞中βcatenin蛋白的相對表達量均有所降低，并且miRNA-200a+紫杉醇組細胞中β-catenin蛋白的相對表達量明顯低于紫杉醇組（P＜0.01）。結果提示，上調miRNA-200a表達可通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路增強A549細胞對紫杉醇化療藥物的敏感度。

總之，本研究通過體外實驗證實上調miRNA-200a表達能夠增強A549細胞對紫杉醇化療藥物的敏感度，其作用機制與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，也提示miRNA-200a可能是提高紫杉醇放療敏感度的潛在靶點，為治療非小細胞肺癌提供了新的線索。