陳康，金澄宇，努爾蘭·阿汗

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，烏魯木齊830000

據(jù)統(tǒng)計(jì)，食管癌占全球惡性腫瘤發(fā)病率的第9位，是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有典型的區(qū)域和民族特征[1-2]。食管癌在中國(guó)高發(fā)，尤其是生活在新疆的哈薩克族尤為突出[3]。相關(guān)研究從分子遺傳學(xué)上分析食管癌的發(fā)生與葉酸的缺乏和代謝障礙有關(guān)，葉酸是調(diào)節(jié)DNA正常甲基化和保持其完整性的重要物質(zhì)，亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）則是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶[4-6]。C677T和A1298C是MTHFR基因的多態(tài)性位點(diǎn)[7]，其突變可導(dǎo)致MTHFR活性降低，影響體內(nèi)葉酸的代謝，從而可能導(dǎo)致食管癌的發(fā)生[8]。本研究分析了MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性與哈薩克族食管癌發(fā)病率的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年2月至2017年2月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院接受治療的78例哈薩克族食管癌患者為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)診斷確診；②均在本地區(qū)居住超過(guò)5年。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月有急慢性感染或自身免疫性疾病者；②合并其他原發(fā)性惡性腫瘤者。觀察組中，男49例，女29例；年齡40～63歲，平均（51.02±9.88）歲。同時(shí)選取相同民族、地區(qū)、居住年限的健康者234例為對(duì)照組。對(duì)照組中，男149例，女85例；年齡41～63歲，平均（50.82±10.11）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有受試者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 基因多態(tài)性檢測(cè)

抽取受試者清晨空腹外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。應(yīng)用基因組DNA小量抽提試劑盒（購(gòu)自上海生工生物工程有限公司）提取基因組DNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)檢測(cè)MTHFR基因[9-10]，MTHFR基因C677T的上游引物為5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，下游引物為 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'；MTHFR基因A1298C的上游引物為5'-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3'，下游引物為5'-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3'。PCR 體系（25 μl）：基因組 DNA（5 μl），10 pmol/μl的上下游引物（各2 μl），2.5 mmol/L 的 1×dNTP（4 μl）、2.5 U/μl Taq酶（含Mg2+，1 μl），10×PCR Buffe（r5 μl），加水補(bǔ)足至25 μl。PCR 擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，94℃ 1 min，60.5℃1 min，72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8 min。將PCR產(chǎn)物用HinfⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，在37℃條件下消化13 h，然后用2%瓊脂糖凝膠電泳，確定MTHFR基因型。

1.3 膳食調(diào)查

采用24 h膳食回顧調(diào)查表，對(duì)患者的飲食進(jìn)行嚴(yán)格的定量，計(jì)算患者的能量、蛋白質(zhì)、硒、維生素C、維生素E和葉酸的平均攝入量，且同中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量（dietary reference intake，DRI）對(duì)比計(jì)算比率值，比率值=實(shí)際攝入量/推薦攝入量×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)分析樣本-是否具有群體代表性；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因 C677 T和 A1298 C多態(tài)性檢測(cè)

MTHFRC677T基因型可分為野生型CC（173bp）、雜合型CT（173 bp/125 bp/48 bp）和變異型TT（125 bp/48 bp）；MTHFRA1298C基因型可分為野生型AA（56 bp）、雜合型 AC（56 bp/84 bp）和變異型 CC（84 bp）。

2.2 MTHFR C677 T和MTHFR A1298 C基因型分布及等位基因頻率的比較

觀察組與對(duì)照組MTHFRC677T基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.271，P=0.873；χ2=0.232，P=0.630）；觀察組與對(duì)照組MTHFRA1298C基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.381，P=0.501；χ2=0.000，P=1.000）。說(shuō)明MTHRFC677T和A1298C基因型頻率均已達(dá)到遺傳平衡，具有人群代表性。（表1、表2）

表2 兩組受試者的MTHFR A1298 C基因型分布及等位基因頻率[ n（%）]

2.3 膳食調(diào)查結(jié)果

觀察組攝入的能量、蛋白質(zhì)、硒、維生素C、維生素E和葉酸的DRI比率值均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表3 兩組受試者各種膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入的DRI比率值比較（%，±s）

表3 兩組受試者各種膳食營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入的DRI比率值比較（%，±s）

組別觀察組（n=78）對(duì)照組（n=234）t值P值能量70.12±2.24 101.43±1.89-120.782 0.000蛋白質(zhì)89.22±24.16 102.11±17.43-5.103 0.000鐵硒201.14±60.03 210.44±50.46-1.342 0.181 80.10±12.21 144.06±13.53-37.020 0.000維生素C 30.01±4.13 35.44±5.21-8.367 0.000維生素E 80.81±21.03 90.11±21.74-3.298 0.001葉酸40.24±9.81 88.56±8.94-40.330 0.000

3 討論

食管癌是中國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生原因可能是相關(guān)基因突變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生成并在食管處增殖，嚴(yán)重影響了人們的生活水平和生命健康。目前臨床上對(duì)食管癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，因此，尋找食管癌的具體發(fā)病原因成為研究的熱點(diǎn)之一[11]。葉酸可為細(xì)胞內(nèi)DNA正常甲基化和核苷酸從頭合成提供甲基基團(tuán)，但其必須在體內(nèi)正常細(xì)胞中代謝后才可發(fā)揮此生物學(xué)功能，因此葉酸的缺乏或代謝障礙可能影響細(xì)胞DNA的合成及完整性，從而造成DNA在復(fù)制過(guò)程中突變率升高[12]。在葉酸的代謝過(guò)程中，MTHFR是非常關(guān)鍵的催化酶，其可以催化5,10-亞甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸，而后者是細(xì)胞內(nèi)通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸合成的原料之一。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因具有多態(tài)性，其中最常見(jiàn)的是C677T和A1298C多態(tài)，MTHFR基因上這2個(gè)位點(diǎn)的改變都會(huì)使其編碼的酶活性顯著降低，從而影響葉酸的代謝，導(dǎo)致體內(nèi)葉酸代謝出現(xiàn)障礙[13]。體內(nèi)的葉酸水平除了受到基因影響，同時(shí)也會(huì)受到飲食和生活習(xí)慣的影響，如蔬菜水果的攝入量、吸煙、飲酒以及熏制肉品的食用等[14]。哈薩克族人生活在新疆北部，生活相對(duì)封閉，主要從事牧業(yè)勞動(dòng)，遺傳背景及生活方式較為單一，蔬菜和水果攝入量較少，并常食用熏制馬肉且有飲酒習(xí)慣，因此葉酸的攝入量相對(duì)較少，從而影響DNA正常甲基化、DNA從頭合成以及DNA修復(fù)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，容易造成基因突變，誘發(fā)食管癌的發(fā)生。Hardy-Weinberg遺傳平衡是檢驗(yàn)樣品是否具有代表性的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[15]，因此本文采用該標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量所選患者是否具有代表性。結(jié)果表明，觀察組和對(duì)照組受試者M(jìn)THFR基因C677T和A1298C分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，證明所選樣本具有代表性，所得結(jié)果具有科學(xué)的前提。

基因多態(tài)性是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因。本研究中瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTHFRC677T基因型可分為野生型CC（173 bp）、雜合型CT（173 bp/125 bp/48 bp）和變異型TT（125 bp/48 bp）；MTHFRA1298C基因型可分為野生型 AA（56 bp）、雜合型 AC（56 bp/84 bp）和變異型CC（84 bp），表明MTHFR基因具有多態(tài)性。

C677T和A1298C是MTHFR基因常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，有關(guān)研究表明MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性與腫瘤疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組與對(duì)照組MTHFRC677T基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組和對(duì)照組MTHFRA1298C基因型分布和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性與食管癌的發(fā)生無(wú)關(guān)，不是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的原因，與張力為等[17]和張金芳等[18]的研究結(jié)果一致。然而，王秀梅等[19]卻在研究中得出結(jié)論，MTHFR基因C677T多態(tài)性是哈薩克族食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素；劉靜等[20]的一項(xiàng)Meta分析探討了MTHFR基因多態(tài)性與中國(guó)人群食管癌易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示，中國(guó)人群MTHFR基因C677T多態(tài)性與食管癌易感性有關(guān)，MTHFR基因A1298C多態(tài)性與食管癌易感性無(wú)關(guān)。由此可見(jiàn)，有關(guān)MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性與食管癌發(fā)病關(guān)系的結(jié)論差異較大。這可能是因?yàn)槭彻馨┌l(fā)生可能是多基因聯(lián)合造成的，需對(duì)更多基因進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，也可能是受限于本研究中的樣本量，需要更大的樣本量，才能得出更準(zhǔn)確、更具代表性的結(jié)果。

食管癌發(fā)病率與MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性關(guān)系的研究結(jié)果雖不盡相同，但均提示與患者的飲食和生活習(xí)慣有關(guān)。由于腫瘤的發(fā)生是多因素長(zhǎng)期積累的結(jié)果，因此要從患者的飲食和生活習(xí)慣方面進(jìn)行全面考量，對(duì)各種致病因素進(jìn)行系統(tǒng)總結(jié)，才能得到相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究探討了食管癌患者及健康者攝入的能量、蛋白質(zhì)、硒、維生素C、維生素E和葉酸水平，結(jié)果顯示，觀察組攝入的能量、蛋白質(zhì)、硒、維生素C、維生素E和葉酸的DRI比率值均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。說(shuō)明飲食和生活習(xí)慣可能與哈薩克族居民食管癌的發(fā)生有一定的關(guān)系，飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣不合理，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)與葉酸代謝相關(guān)物質(zhì)的缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致DNA的合成與完整性遭到破壞，基因突變的概率增加，最終促進(jìn)食管癌的發(fā)生。

綜上所述，MTHFR基因C677T和A1298C多態(tài)性與哈薩克族食管癌發(fā)病無(wú)明顯關(guān)系，食管癌的發(fā)生可能與哈薩克族居民的飲食和生活習(xí)慣有關(guān)。因此，臨床上預(yù)防食管癌的發(fā)生要從飲食和生活習(xí)慣上進(jìn)行控制，同時(shí)本研究的樣本量有限，需要進(jìn)行更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，從而尋找與食管癌關(guān)系密切的基因多態(tài)性位點(diǎn)。