張晉，張丹杰#，李少民，靳耀峰，王原

西安交通大學第二附屬醫(yī)院1胸外科，2病理科，西安710048

3陜西省人民醫(yī)院病理科，西安710068

食管癌（esophageal carcinoma，EC）屬于十分常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多發(fā)生于食管上皮，發(fā)病隱匿，患者早期無典型的臨床癥狀，因此，80%以上的EC患者確診時已經(jīng)進展至晚期階段，從而嚴重影響了患者的預后[1]。目前，關于食管鱗癌的發(fā)病機制尚不明確，且患者的早期癥狀不典型，從而為臨床診斷和治療帶來較大的困難[2]。與其他惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的病理過程一樣，EC的進展也是一個涉及多因素、多基因突變的復雜過程。有研究顯示，EC組織分子水平的改變早于臨床表現(xiàn)的出現(xiàn)，因此，早期診斷和干預對逆轉(zhuǎn)食管鱗狀上皮低級別上皮內(nèi)瘤變、降低EC的發(fā)病率十分重要[3]。其中，抑癌基因甲基化屬于表觀遺傳學的范疇，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，是近幾年的研究熱點[4]。PCDH8基因?qū)儆诜蔷奂栽}黏蛋白（protocadherin，PCDH）基因家族的成員之一，在很多腫瘤組織中的表達水平較低，且啟動子發(fā)生甲基化，被認為是一種候補抑癌基因[5]。目前，關于PCDH8基因在EC組織中的表達情況尚無確切的研究，因此，本研究通過分析EC患者PCDH8基因啟動子甲基化的異常表達情況，為EC的早期診斷和治療提供新的靶點，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年11月至2017年10月西安交通大學第二附屬醫(yī)院和陜西省人民醫(yī)院病理科保存的74例EC患者的EC組織標本及其相應的癌旁（距腫瘤組織邊緣≥5 cm）正常組織標本。全部患者均有完整的臨床資料，均經(jīng)內(nèi)鏡和病理組織學檢查確診，且術前均未行化療及放療；排除合并慢性腎病、腎功能不全等疾病的患者。74例EC患者中，男41例，女33例；年齡為33～77歲，平均年齡為（54.42±7.36）歲；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期27例；世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）組織學分級：Ⅰ級16例，Ⅱ級25例，Ⅲ級33例。

1.2 儀器與試劑

Allegra TM64R型臺式高速冷凍離心機購自德國Beckman公司，OLYMPUS CX41倒置光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，DJ-3005電子分析天平購自日本SHINKO公司，DK-SD恒溫水浴搖床購自上海醫(yī)用恒溫設備廠，Mastercycler ep realplex全自動熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司，HWA-50D恒溫水浴鍋購自韓國Autonics公司，UV-8000紫外分光光度計購自上海精密儀器儀表公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，DNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，抗PCDH8單克隆抗體購自日本Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學染色法按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作。①按照病理編號調(diào)出西安交通大學第二附屬醫(yī)院和陜西省人民醫(yī)院病理科存檔的石蠟包埋組織切片，脫蠟水化后，切片，置于載玻片上，烘干48 h后待用；②抗原熱修復；③滅活內(nèi)源性過氧化物酶；④封閉；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑顯色；⑧蘇木精復染；⑨將染色后的病理切片置于400倍視鏡下觀察，PCDH8位于細胞膜上，隨機選擇10個視野，觀察細胞的陽性表達情況。

1.3.2 組織DNA提取將組織切片脫蠟水化后，置于EP管中；加入150 μl的丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）緩沖液和10 μl的蛋白酶K振蕩混勻，置于56℃恒溫水浴鍋中15 min，80℃恒溫水浴鍋中15 min；采用鹽析法提取DNA。

1.3.3 DNA重亞硫酸氫鹽修飾及純化按照試劑盒說明書的實驗步驟進行操作。取2 μl DNA加入去離子水稀釋至18 μl，加入2 μl 3 mol/L的氫氧化鈉溶液，混勻，37℃孵育15 min；加入4.8 mol/L的重亞硫酸鈉 278 μl和100 mmol/L 的對苯二酚2 μl，56℃孵育4 h，將標本除鹽后加入3 mol/L的氫氧化鈉溶液22 μl，37℃孵育 15 min。最后，將所得DNA經(jīng)醋酸鈉和乙醇沉淀后，加入20 μl的TE溶液溶解。

1.3.4 甲基化特異性PCR 采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）檢測PCDH8基因啟動子的甲基化狀態(tài)。將 21 μl的反應體系（Taq Mix10 μl+cDNA模板 2 μl+上下游引物各 1 μl+RNase-fress水 7 μl）按程序擴增：95℃3 min預變性；95℃30 s變性，60℃30 s退火，72℃5 min延伸，循環(huán)40次。引物序列如下，β-actin，334 bp，上游引物：5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；甲基化PCDH8，156 bp，上游引物：5'-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3'；下游引物：5'-AAA TCAGGCTCATTACGAAC-3'；非甲基化PCDH8，156 bp，上游引物：5'-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3'；下游引物：5'-AAAATCACACTCTTTACAAA-3'。

1.4 結(jié)果判定標準

1.4.1 免疫組化結(jié)果判定PCDH8蛋白陽性表達于細胞膜，染色呈棕黃色。①根據(jù)陽性細胞所占比例評分：陽性細所占比例為0，計0分；陽性細所占比例≤25%，計1分；陽性細所占比例為26%～50%，計2分；陽性細所占比例為51%～75%，計3分；陽性細所占比例＞75%，計4分。②根據(jù)細胞染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)染色指數(shù)（labeling index，LI）判定結(jié)果。LI=陽性細胞所占比例評分×細胞染色強度評分。將總分數(shù)分為1～4級：0～1分為 1級，2～4分為2級，5～8分為 3級，9～12分為 4級。1級和2級為PCDH8蛋白低表達，2級和3級為PCDH8蛋白高表達。

1.4.2 MSP結(jié)果判斷甲基化陽性：甲基化引物擴增陽性，非甲基化引物擴增陽性/陰性；非甲基化陽性：甲基化引物擴增陰性，非甲基化引物擴增陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EC組織和癌旁組織中PCDH 8蛋白的表達情況

癌旁組織中可見大量細胞的細胞膜被染成黃色，而EC組織中基本未見陽性染色（圖1）。EC組織中的PCDH8蛋白的高表達率為28.4%（21/74），明顯低于癌旁正常組織的64.9%（48/74），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=19.793，P＜0.01）。

圖1 癌旁組織和EC組織中PCDH 8蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.2 EC組織和癌旁組織中PCDH 8基因啟動子的甲基化狀態(tài)

MSP檢測結(jié)果顯示，EC組織中PCDH8基因啟動子甲基化率為87.8%（65/74），明顯高于癌旁正常組織的 16.2%（12/74），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=76.044，P＜0.01）。

2.3 PCDH 8蛋白表達情況與EC患者臨床特征的關系

PCDH8蛋白的高表達與EC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、WHO組織學分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無關（P＞0.05）。（表1）

2.4 PCDH 8基因啟動子甲基化率與EC患者臨床特征的關系

PCDH8基因啟動子的甲基化率與EC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、WHO組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關（P＞0.05），但是PCDH8基因啟動子的甲基化率與EC患者的TNM分期有關（P＜0.05）。（表2）

表1 不同臨床特征EC患者EC組織中PCDH 8蛋白的表達情況（ n=74）

表2 不同臨床特征EC患者EC組織中PCDH 8基因的甲基化情況（ n=74）

3 討論

食管癌是臨床上較為常見的、病死率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病人群的年齡范圍較大，以鱗狀細胞癌為主，近年來，在中國，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[6]。由于EC發(fā)病早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，而且有研究顯示其分子水平的改變，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控等早于臨床表現(xiàn)，因此，早期診斷和干預對于逆轉(zhuǎn)食管鱗狀上皮低級別上皮內(nèi)瘤變、降低EC的發(fā)病率、改善EC患者的預后具有十分重要的臨床價值[7-8]。近幾年，表觀遺傳學與腫瘤發(fā)生機制之間的關系研究一直是熱點，它與遺傳學改變不同的是，核苷酸序列未發(fā)生變化，而是通過DNA甲基化、染色體重構(gòu)和組蛋白去乙?；日{(diào)控基因的表達，參與機體的病理、生理過程[9-10]。其中，DNA甲基化在腫瘤的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用，通過抑制抑癌基因的表達，促使腫瘤細胞增殖、侵襲等。因此，抑癌基因的甲基化為腫瘤的治療提供了新的潛在靶點[11-12]。

PCDH家族是目前神經(jīng)系統(tǒng)領域研究較為深入的細胞黏附分子家族，但是其與腫瘤的相關性研究尚少[13]。PCDH8屬于非聚集性PCDHδ2基因家族的成員之一，它除了具有神經(jīng)系統(tǒng)的特異性細胞黏附功能外，與胃癌、鼻咽癌、膀胱癌等腫瘤的發(fā)生也密切相關[14-15]。但是，目前關于PCDH8基因與EC關系的研究較少，而本研究主要探討了PCDH8蛋白表達和基因啟動子區(qū)域甲基化水平與EC患者臨床特征的關系，為EC發(fā)病機制以及治療方法的研究提供了新的方向。本研究結(jié)果顯示，EC組織中PCDH8蛋白的高表達率明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01），但是未發(fā)現(xiàn)與患者年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、WHO組織學分級以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關。通過分子學水平研究發(fā)現(xiàn)，EC組織中PCDH8基因啟動子甲基化率明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且與EC患者的TNM分期有關（P＜0.05）。

提示PCDH8基因啟動子區(qū)域甲基化可能發(fā)生在EC的整個疾病進展階段，是EC發(fā)生、發(fā)展的一個重要危險因素和預測指標。本研究由于納入的樣本量偏少或者病理組織保存時間過長，未發(fā)現(xiàn)PCDH8蛋白與EC患者臨床特征的關系以及PCDH8基因甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系，需要進一步探討。

綜上所述，PCDH8蛋白和基因在EC組織中的表達情況，可能與基因啟動子區(qū)域甲基化有關，可作為EC診斷和治療的新靶點。