李彬,自加吉,孫美濤,王唯斯,張若鵬,嚴(yán)長(zhǎng)寶,熊偉
1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000;2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,云南 大理 671000;3.大理白族自治州第一人民醫(yī)院 病理科,云南 大理 671000
子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤,多見(jiàn)于50歲以上絕經(jīng)期和絕經(jīng)期后婦女,以50~59歲為發(fā)病高峰,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì),病死率高,危害性大[1]。子宮內(nèi)膜癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一,每年有近20萬(wàn)的新發(fā)病例,在常見(jiàn)婦科惡性腫瘤中病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌[1]。其發(fā)病與生活方式密切相關(guān),發(fā)病率在各地區(qū)有差異,在北美和歐洲發(fā)病率僅次于乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌,高居女性生殖系統(tǒng)癌癥的首位[2]。在我國(guó),隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)條件的改善,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率亦逐年升高,目前僅次于宮頸癌,居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[3]。因此,尋找與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因,對(duì)于子宮內(nèi)膜癌術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測(cè)和增加新的藥物治療靶點(diǎn)具有重要意義。
子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)特性不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì),與核外的線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)也有一定的關(guān)系[4]。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子(mitochondrial transcription termination fac?tor,MTERF)是一類由核基因編碼,通過(guò)特殊方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體,并能與mtDNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì),在mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。MTERF家族有4個(gè)成員,其中MTERF2又稱線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子D3(MTERFD3)或線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子(mitochondrial transcription termina?tion-like factor,MTERFL)[6-7]。MTERF2基因是在比較正常血清培養(yǎng)與血清饑餓培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜差異時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞增殖抑制基因[7]。人MTERF2基因位于染色體12q23.3,可編碼由385個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì),定位于線粒體內(nèi)[8-9]。研究表明,MTERF2蛋白在線粒體內(nèi)的含量相對(duì)豐富,是線粒體擬核的重要組成成分[10]。人MTERF2蛋白在體內(nèi)與mtDNA的結(jié)合沒(méi)有序列特異性,主要參與線粒體基因的表達(dá)調(diào)控和維持線粒體基因組的穩(wěn)定性[11-13]。目前,對(duì)于MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。我們擬利用現(xiàn)有的腫瘤生物信息數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。
設(shè)置的Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.oncomine.org)篩選條件為:①Gene:MTERFD3;②Analysis Type:Cancer vs.Normal Analysis;③Cancer Type:Other Cancer;④Date Type:DNA copy number;⑤Simple Type:Clinical Specimen;⑥臨界值設(shè)定條件:P<1E-4,fold change 2,gene rank=top 10% 。
通過(guò)cBioportal在線工具(http://www.cbioportal.org)分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的突變情況。數(shù)據(jù)庫(kù)類型選擇“TCGA,Provisional”,腫瘤類型選擇“endometrial carcinoma”,數(shù)據(jù)類型選擇“Mutation and CNA”,基因選擇“MTERF2”。
通過(guò)基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)數(shù)據(jù)庫(kù),分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異,以及人體其他腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中MTERF2基因的表達(dá)差異。
通過(guò)MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)(http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw)分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中的甲基化水平。
從OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncolnc.org)選擇在TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)樣本中的項(xiàng)目,輸入MTERF2基因,高表達(dá)組與低表達(dá)組都設(shè)置為33% ,最終得到178例MTERF2基因高表達(dá)和178例MTERF2基因低表達(dá)樣本進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。
利用String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)分析MTERF2基因在mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中相互作用的基因,并進(jìn)行基因功能富集分析。
正常子宮內(nèi)膜組織和對(duì)應(yīng)的子宮內(nèi)膜癌組織之間MTERF2基因mRNA表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)采用單因素方差分析,均數(shù)間的兩兩比較采用LSD法。MTERF2基因mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Ka?plan-Meier模型進(jìn)行生存分析和Log-Rank檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.005為差異極顯著。
Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示,有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的研究共包括726個(gè)樣本。與正常子宮內(nèi)膜組織相比,MTERF2基因DNA拷貝數(shù)在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜混合性腺癌和子宮內(nèi)膜漿液性腺癌中的表達(dá)均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖1)。
圖1 正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因DNA拷貝數(shù)差異
cBioportal在線分析發(fā)現(xiàn),MTERF2基因編碼的蛋白質(zhì)由385個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,包含mTERF基序。MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中存在錯(cuò)義突變和無(wú)義突變2種突變類型。在子宮內(nèi)膜癌組織中,MTERF2蛋白56位的絲氨酸發(fā)生無(wú)義突變;錯(cuò)義突變分別為33位和136位的苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔‵33L和F136L),255位的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼幔↙255I),379位的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔ˋ379E)。結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因的突變
通過(guò)GEPIA分析TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集中包括306例宮頸癌組織樣本和13例正常宮頸組織樣本。結(jié)果同樣顯示,與正常子宮內(nèi)膜組織相比,MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MTERF2基因在人體31種腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,MTERF2在大多數(shù)腫瘤組織中均呈低表達(dá),但在膽管癌(CHOL)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)、低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG)和胸腺瘤(THYM)中,MTERF2表達(dá)水平比其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)水平增高(圖4)。
圖3 TCGA數(shù)據(jù)集中子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因mRNA表達(dá)差異(*P<0.05)
圖4 人體各種腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中MTERF2基因的表達(dá)差異
在MethHC中,MTERF2基因的轉(zhuǎn)錄模板是NM_001033050,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的一致。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平差異明顯,與正常子宮內(nèi)膜組織相比,子宮內(nèi)膜癌組織中NM_001033050表達(dá)降低,MTERF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低(P<0.005)(圖5)。結(jié)果提示,MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平是影響其在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)水平的因素之一,但可能還存在其他表觀遺傳學(xué)因素能影響MTERF2基因的表達(dá)。
對(duì)OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行Kaplan-Meier分析,結(jié)果顯示MTERF2基因mRNA的表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的總生存時(shí)間無(wú)顯著影響。與高表達(dá)組相比,MTERF2基因低表達(dá)組的子宮內(nèi)膜癌患者總體生存率無(wú)明顯變化(Log-RankP=0.775)(圖6)。
String-DB分析表明MTERF2基因在線粒體基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中處于重要位置,PPI富集P=2.59e-5,節(jié)點(diǎn)數(shù)為11個(gè),與MTERF2相互作用的基因包括線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1(mitochondrial transcription factor B1,TFB1M)和B2(TFB2M)、線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域 1(mitochondrial transcription termi?nation factor domain containing 1,MTERFD1)和 2(MTERFD2)、線粒體RNA聚合酶(mitochondrial RNA polymerase,POLRMT)、單鏈DNA結(jié)合蛋白1(single-strand DNA-binding protein 1,SSBP1)、細(xì)胞色素C氧化酶組裝因子3(cytochrome c oxi?dase assembly factor 3,COA3)、肝癌衍生生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白 3(hepatoma-derived growth factor-re?lated protein 3,HDGFRP3)等(圖7)。與MTERF2有相互作用的基因及其功能富集分析見(jiàn)表1。
表1 與MTERF2基因密切相關(guān)的基因及基因功能富集分析
圖5 MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因甲基化水平
圖6 OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集中MTERF2基因表達(dá)量與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析
Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)整合了GEO、TCGA和已發(fā)表的文獻(xiàn)等來(lái)源的DNA和RNA數(shù)據(jù),是分析癌癥組織和正常組織差異表達(dá)的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。cBioportal在線工具可分析各種基因在各腫瘤組織中的突變情況[15]。GEPIA是北京大學(xué)研制開發(fā)的可用于分析基因在癌癥和正常組織中的差異表達(dá)的在線應(yīng)用,可對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化分析[16]。MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)包含18個(gè)人類各正常組織和腫瘤組織中的DNA甲基化和mRNA/miRNA表達(dá)譜,可用于證明正常和腫瘤組織中的甲基化模式,并分析甲基化和表達(dá)之間的相關(guān)性,還可用于基因組分析揭示差異甲基化基因和基因簇[17]。OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)癌癥數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線Kaplan-Meier生存分析[18]。String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)是分析基因或蛋白質(zhì)相互作用的檢索工具,包含已證實(shí)的和可以預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)資源[19]。
圖7 線粒體轉(zhuǎn)錄過(guò)程中MTERF2基因的位置及其相互作用的基因
惡性腫瘤的發(fā)生不僅與核內(nèi)遺傳物質(zhì)相關(guān),還與核外的mtDNA密切相關(guān)。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護(hù),無(wú)DNA修復(fù)系統(tǒng),處在高氧化應(yīng)激環(huán)境中,容易受電子傳遞鏈產(chǎn)生的自由基的損傷,與化學(xué)致癌物的親和力較核基因組高等原因,使mtDNA具有較高的突變率,可能有潛在的致癌性[20]。研究發(fā)現(xiàn),在多種腫瘤組織及其相應(yīng)的體液標(biāo)本中存在mtDNA突變,如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和大腸癌等,但不同類型的腫瘤組織中所報(bào)道的突變率及突變類型各不相同[21-24]。惡性腫瘤的發(fā)生不僅與mtDNA結(jié)構(gòu)改變相關(guān),還與其數(shù)量有密切聯(lián)系。與正常組織相比,不同類型的腫瘤組織中mtDNA數(shù)量有不同程度的增多或減少[25]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器,線粒體功能障礙與惡性腫瘤、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生密切相關(guān)[26]。研究表明,細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)MTERF2基因顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,細(xì)胞周期阻滯于G1/S期,但并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。MTERF2是調(diào)控線粒體基因表達(dá)的重要因子,目前MTERF2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義尚未見(jiàn)報(bào)道。
本研究中,我們首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在各類型子宮內(nèi)膜癌組織中的DNA拷貝數(shù)變化,發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜組織相比,MTERF2基因DNA拷貝數(shù)在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜混合性腺癌和子宮內(nèi)膜漿液性腺癌中的表達(dá)均沒(méi)有顯著差異。接著,我們利用cBiopor?tal工具分析MTERF2在子宮內(nèi)膜癌中的突變情況,通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在人體各種腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá),說(shuō)明該基因可能對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用,低表達(dá)MTERF2基因會(huì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生,這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。然后,又通過(guò)MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平的變化。結(jié)果顯示,與正常子宮內(nèi)膜組織相比,子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低。提示,除MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平外,可能還有其他表觀遺傳學(xué)因素影響MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)水平。最后,利用Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者總生存時(shí)間的影響,發(fā)現(xiàn)MTERF2基因高、低表達(dá)組的子宮內(nèi)膜癌患者總體生存率無(wú)明顯變化。
此外,我們還對(duì)MTERF2基因在線粒體基因表達(dá)調(diào)控中的作用及其密切相關(guān)基因進(jìn)行了初步探索,通過(guò)String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘發(fā)現(xiàn),MTERF2在線粒體基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控和線粒體基因組維持等過(guò)程中具有重要作用,與MTERFD1、MTERFD2、TFB1M、TFB2M、POLRMT、SSBP1、PTCD1、COA3、HDGFRP3等基因關(guān)系密切,可能共同調(diào)節(jié)線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄。
本研究的優(yōu)勢(shì)在于利用各種在線腫瘤生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),樣本量較大,臨床數(shù)據(jù)資料相對(duì)完整。而不足之處在于,各個(gè)數(shù)據(jù)集中提供的都是mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù),可能無(wú)法完全代表MTERF2蛋白水平的表達(dá)情況。在后續(xù)研究中應(yīng)該結(jié)合Western印跡和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步分析討論。本研究為深入探討MTERF2基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ),也為腫瘤的靶向治療提供新思路。