李彬，自加吉，孫美濤，王唯斯，張若鵬，嚴(yán)長(zhǎng)寶，熊偉

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，云南 大理 671000；3.大理白族自治州第一人民醫(yī)院 病理科，云南 大理 671000

子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，多見于50歲以上絕經(jīng)期和絕經(jīng)期后婦女，以50～59歲為發(fā)病高峰，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，病死率高，危害性大[1]。子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，每年有近20萬的新發(fā)病例，在常見婦科惡性腫瘤中病死率僅次于卵巢癌和宮頸癌[1]。其發(fā)病與生活方式密切相關(guān)，發(fā)病率在各地區(qū)有差異，在北美和歐洲發(fā)病率僅次于乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌，高居女性生殖系統(tǒng)癌癥的首位[2]。在我國(guó)，隨著社會(huì)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)條件的改善，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率亦逐年升高，目前僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[3]。因此，尋找與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測(cè)和增加新的藥物治療靶點(diǎn)具有重要意義。

子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)特性不僅取決于核內(nèi)遺傳物質(zhì)，與核外的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）也有一定的關(guān)系[4]。線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子（mitochondrial transcription termination fac?tor，MTERF）是一類由核基因編碼，通過特殊方式轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，并能與mtDNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，在mtDNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。MTERF家族有4個(gè)成員，其中MTERF2又稱線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子D3（MTERFD3）或線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子（mitochondrial transcription termina?tion-like factor，MTERFL）[6-7]。MTERF2基因是在比較正常血清培養(yǎng)與血清饑餓培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜差異時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞增殖抑制基因[7]。人MTERF2基因位于染色體12q23.3，可編碼由385個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，定位于線粒體內(nèi)[8-9]。研究表明，MTERF2蛋白在線粒體內(nèi)的含量相對(duì)豐富，是線粒體擬核的重要組成成分[10]。人MTERF2蛋白在體內(nèi)與mtDNA的結(jié)合沒有序列特異性，主要參與線粒體基因的表達(dá)調(diào)控和維持線粒體基因組的穩(wěn)定性[11-13]。目前，對(duì)于MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制尚未見報(bào)道。我們擬利用現(xiàn)有的腫瘤生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，通過數(shù)據(jù)挖掘分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因DNA拷貝數(shù)在子宮內(nèi)膜癌中的變化

設(shè)置的Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncomine.org）篩選條件為：①Gene：MTERFD3；②Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③Cancer Type：Other Cancer；④Date Type：DNA copy number；⑤Simple Type：Clinical Specimen；⑥臨界值設(shè)定條件：P＜1E-4，fold change 2，gene rank=top 10% 。

1.2 cBioportal數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌中的突變情況

通過cBioportal在線工具（http://www.cbioportal.org）分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的突變情況。數(shù)據(jù)庫(kù)類型選擇“TCGA，Provisional”，腫瘤類型選擇“endometrial carcinoma”，數(shù)據(jù)類型選擇“Mutation and CNA”，基因選擇“MTERF2”。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在各腫瘤組織中的表達(dá)

通過基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）（http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)，分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異，以及人體其他腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中MTERF2基因的表達(dá)差異。

1.4 MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌中的甲基化水平

通過MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://MethHC.mbc.nctu.edu.tw）分析MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中的甲基化水平。

1.5 OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

從OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncolnc.org）選擇在TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)樣本中的項(xiàng)目，輸入MTERF2基因，高表達(dá)組與低表達(dá)組都設(shè)置為33% ，最終得到178例MTERF2基因高表達(dá)和178例MTERF2基因低表達(dá)樣本進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。

1.6 MTERF2相互作用基因的初探

利用String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）分析MTERF2基因在mtDNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中相互作用的基因，并進(jìn)行基因功能富集分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

正常子宮內(nèi)膜組織和對(duì)應(yīng)的子宮內(nèi)膜癌組織之間MTERF2基因mRNA表達(dá)差異采用t檢驗(yàn)。多組樣本均數(shù)采用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD法。MTERF2基因mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Ka?plan-Meier模型進(jìn)行生存分析和Log-Rank檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.005為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 MTERF2基因DNA拷貝數(shù)與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性。

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，有關(guān)子宮內(nèi)膜癌的研究共包括726個(gè)樣本。與正常子宮內(nèi)膜組織相比，MTERF2基因DNA拷貝數(shù)在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜混合性腺癌和子宮內(nèi)膜漿液性腺癌中的表達(dá)均沒有顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因DNA拷貝數(shù)差異

2.2 子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因的突變

cBioportal在線分析發(fā)現(xiàn)，MTERF2基因編碼的蛋白質(zhì)由385個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含mTERF基序。MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中存在錯(cuò)義突變和無義突變2種突變類型。在子宮內(nèi)膜癌組織中，MTERF2蛋白56位的絲氨酸發(fā)生無義突變；錯(cuò)義突變分別為33位和136位的苯丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱涟彼幔‵33L和F136L），255位的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼幔↙255I），379位的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼幔ˋ379E）。結(jié)果見圖2。

圖2 子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因的突變

2.3 人體各種腫瘤組織及其相應(yīng)正常組織中MTERF2基因的表達(dá)差異

通過GEPIA分析TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包括306例宮頸癌組織樣本和13例正常宮頸組織樣本。結(jié)果同樣顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中低表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MTERF2基因在人體31種腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，MTERF2在大多數(shù)腫瘤組織中均呈低表達(dá)，但在膽管癌（CHOL）、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）、低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）和胸腺瘤（THYM）中，MTERF2表達(dá)水平比其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)水平增高（圖4）。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)集中子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因mRNA表達(dá)差異（*P＜0.05）

圖4 人體各種腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中MTERF2基因的表達(dá)差異

2.4 子宮內(nèi)膜癌中MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分析

在MethHC中，MTERF2基因的轉(zhuǎn)錄模板是NM_001033050，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的一致。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平差異明顯，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中NM_001033050表達(dá)降低，MTERF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低（P＜0.005）（圖5）。結(jié)果提示，MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平是影響其在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)水平的因素之一，但可能還存在其他表觀遺傳學(xué)因素能影響MTERF2基因的表達(dá)。

2.5 MTERF2表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析

對(duì)OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示MTERF2基因mRNA的表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者的總生存時(shí)間無顯著影響。與高表達(dá)組相比，MTERF2基因低表達(dá)組的子宮內(nèi)膜癌患者總體生存率無明顯變化（Log-RankP=0.775）（圖6）。

2.6 與MTERF2相互作用的基因及基因功能富集分析

String-DB分析表明MTERF2基因在線粒體基因轉(zhuǎn)錄過程中處于重要位置，PPI富集P=2.59e-5，節(jié)點(diǎn)數(shù)為11個(gè)，與MTERF2相互作用的基因包括線粒體轉(zhuǎn)錄因子B1（mitochondrial transcription factor B1，TFB1M）和B2（TFB2M）、線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域 1（mitochondrial transcription termi?nation factor domain containing 1，MTERFD1）和 2（MTERFD2）、線粒體RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，POLRMT）、單鏈DNA結(jié)合蛋白1（single-strand DNA-binding protein 1，SSBP1）、細(xì)胞色素C氧化酶組裝因子3（cytochrome c oxi?dase assembly factor 3，COA3）、肝癌衍生生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白 3（hepatoma-derived growth factor-re?lated protein 3，HDGFRP3）等（圖7）。與MTERF2有相互作用的基因及其功能富集分析見表1。

表1 與MTERF2基因密切相關(guān)的基因及基因功能富集分析

圖5 MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因甲基化水平

圖6 OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集中MTERF2基因表達(dá)量與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析

3 討論

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)整合了GEO、TCGA和已發(fā)表的文獻(xiàn)等來源的DNA和RNA數(shù)據(jù)，是分析癌癥組織和正常組織差異表達(dá)的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。cBioportal在線工具可分析各種基因在各腫瘤組織中的突變情況[15]。GEPIA是北京大學(xué)研制開發(fā)的可用于分析基因在癌癥和正常組織中的差異表達(dá)的在線應(yīng)用，可對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行可視化分析[16]。MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)包含18個(gè)人類各正常組織和腫瘤組織中的DNA甲基化和mRNA/miRNA表達(dá)譜，可用于證明正常和腫瘤組織中的甲基化模式，并分析甲基化和表達(dá)之間的相關(guān)性，還可用于基因組分析揭示差異甲基化基因和基因簇[17]。OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)可對(duì)癌癥數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線Kaplan-Meier生存分析[18]。String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)是分析基因或蛋白質(zhì)相互作用的檢索工具，包含已證實(shí)的和可以預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的生物數(shù)據(jù)庫(kù)和網(wǎng)絡(luò)資源[19]。

圖7 線粒體轉(zhuǎn)錄過程中MTERF2基因的位置及其相互作用的基因

惡性腫瘤的發(fā)生不僅與核內(nèi)遺傳物質(zhì)相關(guān)，還與核外的mtDNA密切相關(guān)。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護(hù)，無DNA修復(fù)系統(tǒng)，處在高氧化應(yīng)激環(huán)境中，容易受電子傳遞鏈產(chǎn)生的自由基的損傷，與化學(xué)致癌物的親和力較核基因組高等原因，使mtDNA具有較高的突變率，可能有潛在的致癌性[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤組織及其相應(yīng)的體液標(biāo)本中存在mtDNA突變，如宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和大腸癌等，但不同類型的腫瘤組織中所報(bào)道的突變率及突變類型各不相同[21-24]。惡性腫瘤的發(fā)生不僅與mtDNA結(jié)構(gòu)改變相關(guān)，還與其數(shù)量有密切聯(lián)系。與正常組織相比，不同類型的腫瘤組織中mtDNA數(shù)量有不同程度的增多或減少[25]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，線粒體功能障礙與惡性腫瘤、線粒體糖尿病、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生密切相關(guān)[26]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)MTERF2基因顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，但并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。MTERF2是調(diào)控線粒體基因表達(dá)的重要因子，目前MTERF2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其預(yù)后意義尚未見報(bào)道。

本研究中，我們首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在各類型子宮內(nèi)膜癌組織中的DNA拷貝數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜組織相比，MTERF2基因DNA拷貝數(shù)在子宮內(nèi)膜樣腺癌、子宮內(nèi)膜混合性腺癌和子宮內(nèi)膜漿液性腺癌中的表達(dá)均沒有顯著差異。接著，我們利用cBiopor?tal工具分析MTERF2在子宮內(nèi)膜癌中的突變情況，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因在人體各種腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá)，說明該基因可能對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的抑制作用，低表達(dá)MTERF2基因會(huì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生，這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。然后，又通過MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平的變化。結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中MTERF2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平顯著降低。提示，除MTERF2基因DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平外，可能還有其他表觀遺傳學(xué)因素影響MTERF2基因在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)水平。最后，利用Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF2基因表達(dá)水平對(duì)子宮內(nèi)膜癌患者總生存時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)MTERF2基因高、低表達(dá)組的子宮內(nèi)膜癌患者總體生存率無明顯變化。

此外，我們還對(duì)MTERF2基因在線粒體基因表達(dá)調(diào)控中的作用及其密切相關(guān)基因進(jìn)行了初步探索，通過String-DB數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘發(fā)現(xiàn)，MTERF2在線粒體基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控和線粒體基因組維持等過程中具有重要作用，與MTERFD1、MTERFD2、TFB1M、TFB2M、POLRMT、SSBP1、PTCD1、COA3、HDGFRP3等基因關(guān)系密切，可能共同調(diào)節(jié)線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于利用各種在線腫瘤生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，樣本量較大，臨床數(shù)據(jù)資料相對(duì)完整。而不足之處在于，各個(gè)數(shù)據(jù)集中提供的都是mRNA水平的表達(dá)數(shù)據(jù)，可能無法完全代表MTERF2蛋白水平的表達(dá)情況。在后續(xù)研究中應(yīng)該結(jié)合Western印跡和免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步分析討論。本研究為深入探討MTERF2基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為腫瘤的靶向治療提供新思路。