郭慧琴，吳中強(qiáng)，毛秀麗，王歡，王蘭，許鵬,2

1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.上海交通大學(xué) Bio-X研究院，上海 200030

鎘是當(dāng)今重金屬污染中涉及面積最廣、危害最大的重金屬元素之一[1]。鎘主要通過(guò)食物攝取、吸煙等方式進(jìn)入人體，并且隨血液流動(dòng)而在體內(nèi)多種器官中積累并產(chǎn)生毒性效應(yīng)。其中，鎘的生殖毒性近年來(lái)已成為研究熱點(diǎn)。研究顯示，鎘一方面可以抑制正常育齡男女的配子發(fā)生；另一方面可能會(huì)導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局，如早產(chǎn)、胎兒生長(zhǎng)受限等[2-3]。

胎兒生長(zhǎng)受限與多種因素（母體因素、胎盤因素和胎兒因素）相關(guān)[4]。一系列流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胎盤可能是鎘誘發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限的毒性作用的主要靶器官之一[5-6]。我們的前期研究顯示，孕期母體鎘暴露的小鼠肝臟和腎臟中的鎘積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胎盤[7]；并且，妊娠期母體肝臟和腎臟功能的異常有可能引起多種不良妊娠結(jié)局并對(duì)胎兒發(fā)育產(chǎn)生影響[8-10]。因此，對(duì)孕期鎘暴露的母體肝臟和腎臟的研究，可能有助于進(jìn)一步闡明孕期鎘暴露致胎兒生長(zhǎng)受限的毒性機(jī)制。目前，研究者普遍認(rèn)為，由自由基介導(dǎo)的生物體內(nèi)的氧化損傷是鎘毒性效應(yīng)的主要體現(xiàn)。鑒于此，本研究利用課題組前期建立的孕期鎘暴露致胎兒生長(zhǎng)受限小鼠模型，分別檢測(cè)鎘暴露小鼠肝臟和腎臟組織中抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）］活性、脂質(zhì)過(guò)氧化水平（MDA含量）、蛋白質(zhì)羰基化（PCO含量）水平和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)（DPC）的變化情況，旨在特異性檢測(cè)孕期鎘暴露對(duì)母體肝臟和腎臟的氧化損傷程度，從而為揭示孕期母體鎘暴露致胎兒生長(zhǎng)受限作用的分子調(diào)控機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

性成熟的8周齡C57BL/6小鼠（雄性小鼠體重25～28 g，雌性小鼠體重：0～23 g）購(gòu)自北京生命河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）（分析純，天津博迪化工有限公司）實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水配成20 000 mg/L的母液；標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液（1000 mg/L，國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）；SOD、CAT、GPx、丙二醛（MDA）含量和總蛋白含量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Tris、蛋白酶K和熒光染料Hoechest33258（Sigma公司）；鹽酸胍和EDTA（分析純，北京化工廠）；2，4-二硝基苯肼（DNPH）（分析純，天津Kermal化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

C57BL/6小鼠嚴(yán)格按照中國(guó)輻射防護(hù)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)制訂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作相關(guān)規(guī)范，在中國(guó)輻射防護(hù)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行小鼠的日常飼養(yǎng)和管理，飼養(yǎng)溫度為（23±1）℃，濕度為（60±5）% ，光照周期12 h/12 h，自由采食飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始進(jìn)行合籠操作。合籠操作每天晚上9點(diǎn)開(kāi)始（每籠中放置1只雄鼠與2～3只雌鼠），次日早晨7點(diǎn)檢查陰栓，以出現(xiàn)陰栓的當(dāng)天作為妊娠第0.5 d（Embryonic 0.5，E0.5）。自E7.5開(kāi)始，將45只體重相近的孕鼠分為3組，分別喂食0、20和40 mg/L氯化鎘（CdCl2）溶液。喂食的CdCl2溶液每天更換，并且用原子吸收儀對(duì)相關(guān)溶液進(jìn)行檢測(cè)以確保濃度恒定。分別于E13.5、E16.5和E19.5收集各組小鼠的胎兒、胎盤、肝臟等組織標(biāo)本，每一妊娠階段5只動(dòng)物。通過(guò)比較各組小鼠在不同妊娠時(shí)期的胎兒數(shù)量、胎兒胎盤重量，確認(rèn)孕期鎘暴露致胎兒生長(zhǎng)受限動(dòng)物模型建立成功。所有材料收集后立即置于液氮內(nèi)凍存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)取用。

1.3 樣品制備及生理生化指標(biāo)測(cè)定

將孕鼠的肝臟、腎臟組織按組織質(zhì)量體積比（1 g/4 mL）加入磷酸緩沖液（PBS，pH7.4），電動(dòng)勻漿器制備20% 的組織勻漿液，4℃、2500 r/min離心 10 min，取上清備用。SOD、CAT、GPx活性、MDA含量和蛋白含量采用試劑盒測(cè)定；PCO和DPC測(cè)定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用x±SD表示，P＜0.05表示存在顯著性差異，P＜0.01表示存在極顯著性差異。

2 結(jié)果

本課題組的前期研究表明，孕期母體鎘暴露會(huì)導(dǎo)致妊娠末期（E19.5）胎兒重量顯著性降低[7]，因此本研究?jī)H對(duì)E16.5和E19.5的小鼠肝臟和腎臟樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2.1 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織抗氧化酶活性的影響

2.1.1 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織SOD活性的影響 由圖1A、B可見(jiàn)，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的SOD活性均高于對(duì)照組。E19.5時(shí)，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟組織中的SOD活性顯著性升高，而腎臟中的SOD活性無(wú)顯著性變化。

2.1.2 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織CAT活性的影響 如圖1C、D所示，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的CAT活性均高于對(duì)照組，表現(xiàn)出CAT活性隨染毒濃度的增加而逐漸升高，并隨染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。E19.5時(shí)，20和40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟組織的CAT活性呈顯著性或極顯著性升高；40 mg/L鎘處理組的肝臟組織CAT活性呈顯著性升高，而20 mg/L鎘處理組的肝臟組織CAT活性則無(wú)顯著性變化。

2.1.3 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織GPx活性的影響 由圖1E、F可知，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的GPx活性均高于對(duì)照組，GPx活性在小鼠肝臟組織中隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，而在小鼠腎臟組織中隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高。在E19.5，20和40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟組織的GPx活性均表現(xiàn)為極顯著性增高。

圖1 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟（A、C和E）和腎臟（B、D和F）抗氧化酶活性的影響（n=5）

2.2 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織MDA含量的影響

所有鎘處理組小鼠肝臟和腎臟組織中的MDA含量均高于對(duì)照組。在小鼠肝臟組織中，MDA含量隨鎘染毒濃度的增加而逐漸升高，隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟的MDA含量在E16.5和E19.5時(shí)均呈顯著性或極顯著性升高；而20、40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟的MDA含量?jī)H在E19.5時(shí)呈極顯著性升高，而在E16.5時(shí)無(wú)顯著性變化（圖2A、B）。

圖2 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中MDA含量的影響（n=5）

2.3 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織PCO含量的影響

圖3A、B顯示，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的PCO含量均高于對(duì)照組，且隨鎘濃度增加而逐漸升高。E19.5時(shí)，20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟的PCO含量均呈顯著性或極顯著性升高。E16.5時(shí)，20和40 mg/L鎘處理組小鼠腎臟的PCO含量呈顯著性升高，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟的PCO含量呈顯著性升高。

2.4 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織DPC的影響

圖4A、B表明，所有鎘處理組小鼠肝臟、腎臟組織中的DPC均高于對(duì)照組，表現(xiàn)出DPC隨染毒濃度和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。E16.5時(shí)，40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟DPC與正常組相比，顯著升高；E19.5時(shí)，20、40 mg/L鎘處理組小鼠肝臟和腎臟的DPC與正常組相比，顯著升高。

圖3 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中PCO含量的影響（n=5）

圖4 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟（A）和腎臟（B）中DPC水平的影響（n=5）

3 討論

3.1 肝臟和腎臟可能是鎘誘發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限的毒性作用的主要靶器官

胎兒生長(zhǎng)受限是圍產(chǎn)期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，在我國(guó)發(fā)病率約為6.39%[12]。該疾病不僅增加圍產(chǎn)期胎兒、嬰幼兒的發(fā)病率和死亡率，限制兒童期、青春期的體格和智能發(fā)育，還可能是成年期Ⅱ型糖尿病、肥胖癥、高血壓、冠心病及精神分裂癥等慢性疾病高發(fā)的重要誘因[12-13]。鎘是誘發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限的一類重要環(huán)境因素[2]，近年來(lái)，鎘致胎兒生長(zhǎng)受限的毒性機(jī)制受到研究者的廣泛關(guān)注。然而，這些研究大都著眼于鎘在胎盤中的積累及其引起的胎盤病理性變化[5-6,14]，對(duì)其他因素的研究相對(duì)較少，如胎兒因素和母體因素。

母體因素也是胎兒生長(zhǎng)受限的一類重要因素，妊娠期的各種并發(fā)癥（如妊娠高血壓）、母體的營(yíng)養(yǎng)不良（如蛋白質(zhì)和能量供應(yīng)不足）都會(huì)對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[4]。肝臟和腎臟是母體的兩類重要代謝器官。妊娠期新陳代謝旺盛和雌激素分泌增多會(huì)加重肝臟和腎臟負(fù)擔(dān)，并導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生很大的改變。更重要的是，患有肝病和腎病的孕婦在妊娠晚期時(shí)，容易發(fā)生一系列的肝臟和腎臟的病理性變化，產(chǎn)生多種不良妊娠結(jié)局（如產(chǎn)后出血、流產(chǎn)），并導(dǎo)致母嬰死亡率的提高[8-10,15-16]。巧合的是，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，孕期母體鎘暴露小鼠的肝臟和腎臟的鎘積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胎盤，并且在肝臟中的鎘積累量約為腎臟的2倍[7]。因此，母體的肝臟、腎臟可能是鎘誘發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限的毒性作用的主要靶器官，并且其毒性損傷效應(yīng)也可能由于鎘積累量的不同而呈現(xiàn)組織特異性的變化。

3.2 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟、腎臟的氧化性損傷作用

鎘的毒性效應(yīng)已有近150年的研究歷史，研究者也已經(jīng)提出了多種分子機(jī)制來(lái)闡釋其毒性機(jī)理，其中氧化損傷機(jī)制受到絕大多數(shù)研究者的認(rèn)同[17]。氧化損傷主要表現(xiàn)為2種方式：直接誘導(dǎo)生物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧、自由基代謝物；間接降低生物體清除氧自由基的能力[18]。后者通過(guò)作用于體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來(lái)完成。SOD、CAT和GPx是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的3種重要酶類，SOD可清除O2-，將其轉(zhuǎn)化為H2O2；而CAT和GPX則可以將H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2[19]。

本研究結(jié)果顯示，SOD活性變化較小，直到E19.5時(shí)，40 mg/L高濃度鎘處理組小鼠肝臟組織的SOD活性才發(fā)生顯著性升高。這可能是由于鎘暴露濃度相對(duì)較低，暴露時(shí)間較短，使得機(jī)體內(nèi)未產(chǎn)生較高水平的O2-，無(wú)法激活2種組織SOD活性發(fā)生變化。而SOD活性僅在肝臟，而不是腎臟中發(fā)生顯著性變化，則可能是由于鎘在肝臟中的積累量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腎臟所致[7]。E19.5的CAT活性較E16.5表現(xiàn)為降低趨勢(shì)，這與“促進(jìn)-抑制”效應(yīng)機(jī)制吻合，即低濃度鎘暴露時(shí),可使生物體內(nèi)的抗氧化酶活性升高，出現(xiàn)“毒性興奮效應(yīng)”；而高濃度時(shí),則通常會(huì)使生物體內(nèi)的抗氧化酶活性受抑制而降低，生物體內(nèi)活性氧過(guò)量積累，導(dǎo)致生物體損傷。與CAT活性表現(xiàn)不同的是，GPx活性在鎘暴露的小鼠肝臟，而不是小鼠腎臟中表現(xiàn)出“促進(jìn)-抑制”效應(yīng)，這可能也是由于鎘在肝臟和腎臟中的鎘積累量的差異[7]。此外，同一時(shí)間，隨著鎘濃度的增加，CAT的活性仍然呈升高趨勢(shì)，可能是因?yàn)殒k濃度在40 mg/L時(shí)，在E19.5沒(méi)有達(dá)到抑制CAT活性的程度，有利于MDA的清除。鎘對(duì)小鼠肝臟、腎臟抗氧化系統(tǒng)的破壞降低了細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力，間接導(dǎo)致小鼠肝臟、腎臟組織的損傷[20]。

3.3 孕期母體鎘暴露對(duì)小鼠肝臟、腎臟的MDA、PCO含量和DPC的影響

鎘在生物體內(nèi)大量積累，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的自由基，當(dāng)抗氧化系統(tǒng)不足以清除體內(nèi)自由基時(shí)，就造成機(jī)體氧化損傷，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可以反映機(jī)體氧化損傷程度[21]。此外，鎘還能破壞核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，對(duì)生物體產(chǎn)生毒性作用，因此，PCO含量和DPC水平也可以作為反映機(jī)體氧化損傷程度的指示物[22-23]。在本研究中，MDA、PCO含量和DPC水平均出現(xiàn)顯著升高。其中PCO含量和DPC水平隨鎘濃度的升高和（或）染毒時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，這與前人的一些研究結(jié)果基本一致[24-27]。而在E19.5，小鼠肝臟的MDA含量相比于E16.5出現(xiàn)了降低的情況，可能與E16.5時(shí)小鼠肝臟的CAT活性仍然沒(méi)有被抑制有關(guān)。同時(shí)，該現(xiàn)象在小鼠肝臟，而不是腎臟中出現(xiàn)則可能與鎘在肝臟和腎臟中的鎘積累量的差異相關(guān)[7]。綜上所述，孕期母體鎘暴露對(duì)母體肝臟和腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷，進(jìn)而可能對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響，不同組織的氧化損傷程度具有差異。

3.4 結(jié)論

肝臟和腎臟可能是孕期鎘暴露誘發(fā)胎兒生長(zhǎng)受限的毒性作用的主要靶器官。

孕期鎘暴露不但能誘導(dǎo)母體肝臟、腎臟的氧化應(yīng)激水平的升高，而且進(jìn)一步導(dǎo)致了母體肝臟、腎臟中脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA生物大分子的損傷，上述指標(biāo)的變化情況可以為解釋孕期母體鎘暴露致胎兒生長(zhǎng)受限的分子調(diào)控機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

孕期鎘暴露誘導(dǎo)的母體肝臟和腎臟的氧化損傷指標(biāo)的變化具有組織特異性，這可能與鎘在母體肝臟和腎臟中的積累量不同有關(guān)。