楊亞欣，劉天，李彤，孫曉宇，汪建華，熊向華，張惟材，葛欣

1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ），化學(xué)名稱為4，5-二氫-4，5-二氧化-1-氫吡咯（2，3f）醌-2，7，9-三羧酸，是繼吡啶核苷酸和核黃素核苷酸之后第3種氧化還原型輔酶，能夠刺激線粒體再生，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生成，具有抗氧化、促進(jìn)認(rèn)知、增強(qiáng)體能等功能[1-4]，有人提出應(yīng)列為B族維生素中的新成員[5]，具有良好的開發(fā)前景。

PQQ合成包括化學(xué)合成和生物合成，化學(xué)合成需要11步反應(yīng)和5步純化，步驟多、產(chǎn)率低且污染環(huán)境；而生物合成步驟少、周期短、成本低，是工業(yè)化生產(chǎn)的惟一可行路線。PQQ產(chǎn)生菌均為革蘭陰性菌，其中以甲醇為惟一碳源的甲基營(yíng)養(yǎng)菌的PQQ產(chǎn)量最高。我們采集了不同地區(qū)的土壤樣品，利用甲醇選擇培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，通過NBT染色和Native-PAGE法篩選得到1株產(chǎn)量為13.3 mg/L的PQQ產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為生絲微菌（Hy?phomicrobium），命名為生絲微菌T28。

1 材料與方法

1.1 材料

甲基營(yíng)養(yǎng)菌 MP688（Methylovorussp.MP688）由本實(shí)驗(yàn)室保存；瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA聚合酶、DNA marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；山梨糖脫氫酶（SDH）由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)純化獲得；測(cè)序及PCR引物合成由北京華大基因科技股份有限公司完成；其他生化試劑（分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。培養(yǎng)基成分見表1～5。

10×非變性緩沖液：Tris amino 30.3 g，甘氨酸144.0 g，pH8.8，定容至1 L。

5×非變性上樣緩沖液：1 mol/L Tris-HCl（pH6.8）12.5 mL，溴酚藍(lán)250 mg，甘油25 mL，加水定容至50 mL。

1.2 NBT染色法篩選PQQ產(chǎn)生菌[6]

取5 g土樣于10 mL無菌水中充分振蕩搖勻，靜置后取1 mL懸液加入盛有25 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、200 r/min富集培養(yǎng)48 h；移取1 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)富集培養(yǎng)3次；將培養(yǎng)物離心，取 20 μL 上清加 4 μL SDH 和 180 μL NBT檢測(cè)液于96孔板，觀察反應(yīng)液顏色的變化；選擇反應(yīng)體系變藍(lán)紫色陽(yáng)性孔的菌液，用無菌水稀釋至 1/104～1/108，分別取 10 μL 涂布于平板篩選培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48～72 h；挑取單菌落于 5 mL HC液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)4 d，取1 mL菌液12 000 r/min 離 心 1 min，菌 體用 500 μL 20 mmol/L的Tris-HCl重懸后超聲波裂解；裂解液離心后取20 μL上清于96孔板中，加入4 μL脫輔基的 SDH，30℃溫育20 min后加入180 μL NBT活性染色液，混勻后觀察反應(yīng)液顏色的變化。

1.3 PQQ產(chǎn)生菌的Native-PAGE法鑒定

PQQ產(chǎn)生菌用HC培養(yǎng)基于30℃培養(yǎng)3 d，取1 mL菌液12 000 r/min離心1 min后棄上清，菌體用500 μL 20 mmol/L Tris-HCl重懸，超聲波裂解，裂解菌液16 μL加4 μL 5×非變性上樣緩沖液制備樣品，進(jìn)行Native-PAGE。剝離電泳凝膠，放入已加入10 mL蒸餾水、3 mL NBT（2 mg/mL）、3 mL TMB、3 mL PMS（2 mg/mL）、山梨糖少許的90 cm平皿中，37℃避光染色5 min。

1.4 16S rDNA序列擴(kuò)增與分析[8]

以PQQ產(chǎn)生菌為模板，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast序列比對(duì)分析。

1.5 PQQ產(chǎn)生菌最適培養(yǎng)條件及PQQ產(chǎn)量測(cè)定

參考生絲微菌的培養(yǎng)條件[9-10]設(shè)計(jì)了幾種培養(yǎng)基配方（表1～5），考察了甲醇濃度、pH值等對(duì)PQQ產(chǎn)生菌生長(zhǎng)和PQQ產(chǎn)量的影響。PQQ產(chǎn)生菌按1% 的接菌量接種于1～6號(hào)100 mL液體培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每12 h檢測(cè)菌液D660nm值，繪制菌株在各培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，確定生絲微菌T28的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。培養(yǎng)1～3 d，用NBT-Gly法[7]測(cè)定PQQ產(chǎn)量；第5～6 d測(cè)定菌體離心上清液的D400nm和D326nm值，根據(jù)公式PQQ=（D326nm-D400nm）×43.376+0.5126計(jì)算PQQ產(chǎn)量。

表1 1～4號(hào)培養(yǎng)基

表2 1～4號(hào)培養(yǎng)基微量元素

表3 5號(hào)培養(yǎng)基

表4 5號(hào)培養(yǎng)基微量元素

表5 富集培養(yǎng)基（HC培養(yǎng)基）和6號(hào)培養(yǎng)基

2 結(jié)果

2.1 PQQ產(chǎn)生菌篩選

從不同地區(qū)不同環(huán)境采集500余個(gè)土壤樣品，NBT染色法初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)15個(gè)樣品反應(yīng)體系變成藍(lán)紫色（圖1）。從15個(gè)樣品中選擇12個(gè)顏色較深的樣品進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如圖2，發(fā)現(xiàn)10個(gè)樣品的菌體裂解液中含PQQ。

2.2 Native-PAGE鑒定菌株產(chǎn)PQQ

以PQQ標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，取反應(yīng)較強(qiáng)的10株菌的菌體裂解液進(jìn)行Native-PAGE后活性染色，結(jié)果如圖3，編號(hào)6、7菌株上清中存在大量PQQ，對(duì)應(yīng)的菌株名為T28、T4。

2.3 16S rDNA序列比對(duì)鑒定菌屬

以相對(duì)PQQ產(chǎn)量較高的T28菌液為模板，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物核酸電泳條帶約1500 bp，與預(yù)期相符（圖4）。PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，序列經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析，表明T28 16S rDNA序列與生絲微菌同源性最高為96% ，因而將該P(yáng)QQ產(chǎn)生菌命名為生絲微菌T28，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5。

圖1 PQQ產(chǎn)生菌初篩結(jié)果

圖2 PQQ產(chǎn)生菌復(fù)篩結(jié)果

圖3 Native-PAGE法定性檢測(cè)PQQ

圖4 PQQ產(chǎn)生菌16S rDNA電泳圖

2.4 生絲微菌T28生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基

考察1～6號(hào)培養(yǎng)基對(duì)PQQ產(chǎn)生菌生長(zhǎng)和PQQ產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6、7。1～4號(hào)培養(yǎng)基中菌密度（D660nm值）最終未達(dá)到1.3，不是T28最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基；6號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)144 h時(shí)D660nm值達(dá)3.57，PQQ產(chǎn)量為2.8 mg/L；5號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)144 h時(shí)PQQ產(chǎn)量為13.3 mg/L，且D660nm值最高，為3.93。

圖5 PQQ產(chǎn)生菌經(jīng)Blast比對(duì)結(jié)果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 生絲微菌T28生長(zhǎng)曲線

圖7 生絲微菌T28的PQQ產(chǎn)量

3 討論

甲基營(yíng)養(yǎng)菌在PQQ生產(chǎn)中具有很好的前景，本實(shí)驗(yàn)室曾篩選得到1株P(guān)QQ產(chǎn)生菌食甲基桿菌MP688，經(jīng)工藝優(yōu)化和遺傳育種PQQ產(chǎn)量超過2000 mg/L。我們還發(fā)現(xiàn)該菌的PQQ合成存在多種調(diào)控機(jī)制，不同甲基營(yíng)養(yǎng)菌調(diào)控機(jī)制存在一定差異。為了研究甲基營(yíng)養(yǎng)菌PQQ合成調(diào)控的一般規(guī)律，我們進(jìn)行了新PQQ產(chǎn)生菌株的篩選。

通過甲醇營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基富集、NBT染色和Na?tive-PAGE篩選，我們獲得了1株新的PQQ產(chǎn)生菌，經(jīng)16S rDNA序列鑒定，初步確定該菌為生絲微菌。與文獻(xiàn)報(bào)道的生絲微菌相比，該菌生長(zhǎng)較緩慢，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)篩選，找到了一種較適宜該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。我們初步發(fā)現(xiàn)該菌PQQ產(chǎn)生條件與本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的食甲基桿菌MP688存在明顯差異，這為我們研究PQQ合成調(diào)控的共性和特性提供了新的生物材料。