汪瀟瀟，李雪，李如利，蔣維，3，吳思思

1.重慶大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫(yī)院，腫瘤轉(zhuǎn)移與個體化診治轉(zhuǎn)化研究重慶市重點實驗室，重慶 400030；2.四川大學(xué) 生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041；3.四川大學(xué) 華西醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心，四川 成都 610041；4.四川大學(xué) 華西醫(yī)院公共實驗技術(shù)中心，四川 成都 610041

膿毒血癥是由感染或創(chuàng)傷等誘發(fā)的劇烈的全身性炎癥反應(yīng)，并引起組織器官繼發(fā)性損傷的臨床全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），進一步發(fā)展會出現(xiàn)多器官功能衰竭，危及生命，影響患者預(yù)后[1-3]。膿毒血癥的發(fā)生機制非常復(fù)雜，近年的研究報道認為其與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)失控密切相關(guān)，但具體調(diào)節(jié)機制尚不清楚[4-5]。因此，深入探討膿毒血癥的病理生理學(xué)機制，進而開發(fā)新的診斷和治療手段是其研究的熱點和難點[5-6]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，存在于真核生物中。miRNA可通過特異性識別并結(jié)合其靶mRNA的3′非編碼區(qū)，發(fā)揮抑制mRNA翻譯或降解靶mRNA的作用，從而抑制靶蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)細胞活動[2-3]。研究表明，miRNA在機體的生理過程中發(fā)揮重要作用，包括參與生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答等[7]。microRNA-193b（miR-193b）和 microRNA-141（miR-141）已被證實參與心血管疾病、腫瘤和感染等疾病的調(diào)控過程[8-12]，但目前未見二者參與調(diào)節(jié)膿毒血癥多器官損傷的研究。我們構(gòu)建了小鼠盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)的膿毒血癥模型，觀察miR-193b和miRNA-141的表達變化，探討二者在膿毒血癥休克中的病理生理學(xué)意義，為膿毒血癥休克提供新的發(fā)病理論基礎(chǔ)及治療策略。

1 材料和方法

1.1 材料

20只8周齡野生型SPF級雄性C57BL/6小鼠購自四川大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于潔凈的層流動物房內(nèi)，溫度、空氣等條件符合標(biāo)準(zhǔn)。

TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Invitrogen）；Bio-Rad iTaq Universal SYBR Green Supermix；Bio-Rad DNAEngine；Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthe?sis kit（CWBIO）；羅氏COBAS INTEGRA 800全自動生化分析儀。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)miRNA序列設(shè)計引物，檢測miR-141（miRBase Reference Sequence：MIMAT0000432-U AACACUGUCUGGUAAAGAUGG） 和 miR-193b（miRBase Reference Sequence：MIMAT0002819-A ACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU），選擇 U6（NCBI ReferenceSequence：NR_004394.1）作 為 定 量 內(nèi)參。用莖環(huán)法設(shè)計以上miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物，U6引物采用Primer 5軟件設(shè)計。引物序列見表1，理論上熒光定量PCR擴增產(chǎn)物U6為94 bp，miR-141和miR-193b為34 bp。

1.3 膿毒血癥休克小鼠模型建立[19]

小鼠用2% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，將其四肢固定于動物實驗臺，37℃保溫，腹部去毛并消毒；腹部正中切開約1.5 cm，尋找、暴露盲腸；將盲腸輕柔牽出，置于無菌紗布上，用6-0號縫合絲線結(jié)扎回盲瓣下方，用19號無菌針頭對結(jié)扎部分盲腸進行單孔穿刺，不對穿盲腸；將牽出的盲腸及其內(nèi)容物復(fù)位回腹腔，用4-0號手術(shù)縫合線關(guān)閉腹壁切口；對照組腹部正中切口并暴露盲腸，但不進行結(jié)扎和穿孔；術(shù)后，于小鼠背部皮下注射1 mL生理鹽水補液，放回籠中正常飼養(yǎng)。

1.4 小鼠血壓測定及組織樣本處理

表1 引物及序列

納入本研究的小鼠隨機分為對照組（n=10）和模型組（n=10）。采用盲腸結(jié)扎穿孔法構(gòu)建膿毒血癥休克模型后24 h，戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口約1 cm，鈍性分離并游離頸總動脈，結(jié)扎遠心端，近心端切口，頸總動脈插管連接八導(dǎo)生理記錄儀（iWorx公司），分別監(jiān)測平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（dia?stolic blood pressure，DBP）、心率（heartrate，HR），隨后經(jīng)腹主動脈取血，血液以肝素抗凝后離心（4000 r/min，4℃）分離血漿，置-70℃保存待測。打開胸腹腔，取心臟、肝臟、肺和小腸組織，用無RNAase的水洗凈后，立即加入TRIzol，剪碎，提取總RNA。

1.5 Real-time PCR檢測組織miR-193b和miR-141的表達

提取對照和休克模型小鼠的心臟、肝臟、肺及小腸組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，用熒光定量PCR引物進行Real-time PCR。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。2組間的比較采用Unpaired stu?dent′st-test進行統(tǒng)計學(xué)分析，組與組之間的差異進一步采用Newman Keulst-test進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 休克小鼠的血壓和心功能指標(biāo)

在小鼠敗血癥模型實驗中，盲腸結(jié)扎穿孔24 h呈休克晚期表現(xiàn)，可見小鼠萎靡、活動明顯減少、毛發(fā)無光澤，心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、血糖水平與對照小鼠相比分別下降20.9% （P＜0.05）、37.9% （P＜0.05）、25.8% （P＜0.05）、32.9% （P＜0.05）和58.7% （P＜0.01），血乳酸水平則明顯增加355% （P＜0.01）（表2），且動物很快發(fā)生多器官衰竭死亡。

表2 對照和休克晚期小鼠的血壓和心功能指標(biāo)

2.2 膿毒血癥休克時miR-193b在心臟組織的表達下降，在肝臟和肺組織的表達增加

采用Real-time PCR檢測對照組和模型組小鼠心臟、肝臟、肺及小腸組織中miR-193b的表達變化，結(jié)果如圖1。與對照組相比，模型組小鼠心臟組織中miR-193b的表達水平下降52.6% （P＜0.05），肝臟和肺組織中miR-193b的表達水平分別增加124.7% 和126.1% （均P＜0.05），小腸組織中miR-193b的表達水平呈增加趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 miR-193b在對照和休克晚期小鼠心臟、肝臟、肺、小腸組織中的表達變化

2.3 膿毒血癥休克時miR-141在肺和小腸組織的表達均增加

采用Real-time PCR檢測對照組和模型組小鼠心臟、肝臟、肺及小腸組織中miR-141的表達變化，結(jié)果如圖2。與對照組相比，模型組小鼠肺和小腸組織中miR-141的表達水平分別增加63.4% 和76.5% （均P＜0.05），心臟和肝臟組織中miR-141的表達水平呈增加趨勢，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 miR-141在對照和休克晚期小鼠心臟、肝臟、肺、小腸組織中的表達變化

3 討論

盲腸結(jié)扎穿孔誘導(dǎo)動物發(fā)生感染性休克的模型被廣泛用于研究膿毒血癥過程中全身多系統(tǒng)、多器官的病理生理學(xué)改變。膿毒血癥是嚴重感染產(chǎn)生的一種全身性炎癥反應(yīng)，進一步可進展為急性呼吸窘迫綜合征、感染性休克和多器官衰竭，其發(fā)生發(fā)展的重要機制之一是促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的失衡。膿毒血癥發(fā)生時，機體釋放促炎性介質(zhì)，如IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等[4,13]，引起過度促炎癥反應(yīng)，進而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征。膿毒癥的發(fā)展機制包含多種細胞內(nèi)及細胞間信號通路如核因子κB（NF-κB）通路、JAK激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）通路、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K/Akt）通路、膽堿能抗炎通路等及其下游的分子[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比，盲腸結(jié)扎穿孔處理的小鼠在術(shù)后24 h呈現(xiàn)休克晚期表現(xiàn)，心率和血壓下降，代謝發(fā)生紊亂，血糖水平降低，血乳酸水平增加，提示心功能障礙，組織缺血缺氧，以無氧酵解為主。這些研究結(jié)果表明，感染性休克晚期出現(xiàn)了以心血管功能障礙和代謝紊亂為特征的多器官損傷[14]。目前，闡明膿毒血癥的病理生理學(xué)特征及其發(fā)病機制，尋找新的診斷及治療靶點已經(jīng)成為感染性休克研究的熱點和難點[4,15]。

miRNA通過影響轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控多種炎癥因子相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子的表達與抑制，各種炎癥因子受體的表達，各種細胞因子及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生、釋放，進而調(diào)控膿毒血癥導(dǎo)致的全身失衡的炎癥反應(yīng)[4,9,15-16]。已有報道表明miRNA可以微調(diào)炎癥通路中的多個靶點進而調(diào)控炎癥[9]，且已證實多個miRNA參與炎癥的調(diào)控[3]。在細菌和病毒刺激時，miR-155均可被激活，調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)[17]。miR-146a也在膿毒血癥發(fā)病過程中發(fā)揮著調(diào)控免疫和炎癥的重要作用[18]。此外，miR-146a、miR-150和miR-223的表達水平均可在一定程度上反映機體炎癥反應(yīng)的狀態(tài)，可作為膿毒血癥預(yù)警、診斷和治療的血清標(biāo)志物。

miR-193b最初被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的轉(zhuǎn)移調(diào)控。炎癥發(fā)生時，人體脂肪細胞中過表達miR-193b顯著抑制趨化因子2和TNF-α的表達，進而減少促炎脂肪因子的分泌，促進具有抗炎作用的脂聯(lián)素的分泌[14]。miR-141是miRNA-200家族成員，參與不同腫瘤的調(diào)節(jié)，影響腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤。卵巢癌中，miR-141通過P38調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。目前尚不清楚miR-193b和miR-141在膿毒血癥中的作用及其調(diào)節(jié)機制[10]。本研究觀察到膿毒血癥休克晚期時，miR-193b在心臟組織中表達下降，而在肝臟和肺組織中的表達水平增加，提示不同組織的miR-193b對感染性休克的反應(yīng)性不同，即受miR-193b調(diào)節(jié)的靶蛋白可能在心臟中表達增加，而在肝臟和肺組織中的表達降低。同時，感染性休克晚期miR-141在肺和小腸組織的表達均增加，提示受miR-141調(diào)節(jié)的靶蛋白可能在肺和小腸組織中的表達降低。我們的研究表明miR-193b和miR-141的表達水平在感染性休克晚期小鼠的不同受累組織中發(fā)生明顯變化，初步證實它們參與膿毒血癥的病理生理調(diào)節(jié)，其可能的機制是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其下游與炎癥相關(guān)的靶蛋白的表達，進而影響各種炎性細胞因子的生成和釋放，從而實現(xiàn)對炎癥反應(yīng)的調(diào)控，但具體機制有待深入探究。我們通過檢測感染性休克晚期小鼠不同受累組織中miR-193b和miR-141的表達水平，觀察到miR-193b在心臟中的表達下降，在肝臟和肺中的表達增加，而miR-141在肺和小腸中的表達均增加。結(jié)果提示miR-193b和miR-141可能參與膿毒血癥受累器官的功能調(diào)節(jié)，是感染性休克防治的潛在新靶點。