高潔，李晨曦，趙輝，康歡榮，杜楠

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤二科，北京 100048

化學(xué)藥物治療（化療）是目前治療惡性腫瘤的主要手段之一[1-2]，而化療耐受是制約臨床腫瘤治療效果的關(guān)鍵因素[3]。耐藥機(jī)制包括藥物吸收降低或排除增多、藥物靶點(diǎn)改變、細(xì)胞修復(fù)功能增強(qiáng)等，關(guān)鍵基因的突變也可能導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。microRNA（miRNA）作為高度保守的非編碼RNA，參與一系列重要的生命過(guò)程[4]。已有研究表明miRNA參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[1,5]。

多種化療藥物對(duì)乳腺癌有效，但很快會(huì)出現(xiàn)耐藥。已有研究證實(shí)miRNA的異?？赡芘c乳腺癌耐藥有關(guān)[9-10]。miRNA可通過(guò)參與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝來(lái)調(diào)控腫瘤耐藥。Chen等發(fā)現(xiàn)miRNA-200c過(guò)表達(dá)可降低靶標(biāo)基因MDR1的表達(dá)和P-糖蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)阿霉素治療的敏感性[11]。miRNA可通過(guò)參與調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)相關(guān)的蛋白表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥。Liang等發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-19可參與乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇、VP-16等藥物的耐藥，是通過(guò)抑制PTEN表達(dá)阻止細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的[12]。miRNA可通過(guò)參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT）的發(fā)生調(diào)控腫瘤耐藥。Cochrane等發(fā)現(xiàn)miRNA-200c通過(guò)抑制靶基因ZEB1的表達(dá)進(jìn)而抑制E鈣粘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生，促進(jìn)腫瘤對(duì)順鉑和紫杉醇發(fā)生耐藥[13]。以上研究結(jié)果表明miRNA與乳腺癌的化療耐藥密切相關(guān)，然而其作用機(jī)制仍然不清晰，對(duì)其進(jìn)行深入探究或可改善化療耐藥，提高腫瘤治療的藥物敏感度，也一直是乳腺癌化療耐藥的研究熱點(diǎn)。

我們發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性乳腺癌順鉑耐藥的細(xì)胞株中miR-19a-3p顯著低表達(dá)，推測(cè)miR-19a-3p在該過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。本研究探討了miR-19a-3p在ER陽(yáng)性乳腺癌化療耐藥中的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

ER陽(yáng)性乳腺癌順鉑敏感細(xì)胞株MCF7-CTRL和耐藥細(xì)胞株MCF7-RE為軍事醫(yī)學(xué)研究院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心免疫學(xué)研究室惠贈(zèng)，正常傳代培養(yǎng)；PIK3CB表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-PIK3CB購(gòu)自北京傲銳東源生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶購(gòu)自Gibco公司；miScriptⅡRT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit購(gòu)自 QIA?GEN公司；RNA寡核苷酸miRNA類(lèi)似物和抑制物購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE 2000、總RNA抽提試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于96孔板中，每孔接種約5×103細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用10 μmol/L順鉑分別處理ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞敏感株和耐藥株48 h，之后每孔加入15 μL MTT試劑（5 mg/mL），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩混勻約10 min至結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的D490nm值，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 細(xì)胞總RNA提取

收取轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用1×PBS緩沖液漂洗3次，加入1 mL TRIzol試劑室溫裂解至細(xì)胞裂解液變得透亮；加入200 μL氯仿，劇烈振蕩10 s，室溫靜置 5 min；4℃、12 000 r/min離心 15 min；小心吸取上層水相移至新管，加500 μL異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置30 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，管底白色沉淀即為總RNA；棄掉上清，加入1 mL 80% 乙醇，上下顛倒混勻；4℃、10 000 r/min離心15 min；棄上清后室溫晾干，用DEPC水溶解沉淀；取適量RNA樣品稀釋后，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，讀取D260nm/D280nm值測(cè)定純度，電泳鑒定RNA的完整性。

1.4 小RNA文庫(kù)（sRNA）構(gòu)建及測(cè)序

用15% 的PAGE膠分離不同大小片段的RNA，回收18～30 nt的片段，在T4RNA連接酶作用下加5′和3′測(cè)序接頭將產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為雙鏈并擴(kuò)增，用PAGE膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收及純化，回收產(chǎn)物溶于EB溶液中，完成文庫(kù)建立。用Agi?lent2100 Bioanalyzer和Step One PlusReal-Time PCR System對(duì)構(gòu)建的sRNA文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量及產(chǎn)量評(píng)估，用IllumimaHiSeq 2500測(cè)序儀完成sRNA文庫(kù)測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析IlluminaHiSeq

IlluminaHiSeq 2500測(cè)序得到長(zhǎng)度為49 nt的序列，通過(guò)數(shù)據(jù)處理去除3′端缺失、5′端污染、插入片段缺失、含polyA等序列后獲得高質(zhì)量的clean reads。對(duì)clean reads的長(zhǎng)度、質(zhì)量和分布等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分類(lèi)和注釋?zhuān)煌ㄟ^(guò)bowtie將sRNA定位到基因組，分析reads在基因組上的分布及表達(dá)情況；用bowtie將reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，注釋已知miRNAs；通過(guò)bowtie將sRNA和Gen?Bank、Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，注釋除miRNA以外的sRNA。

1.6 差異表達(dá)miRNA分析

篩選乳腺癌耐藥細(xì)胞株和敏感株的文庫(kù)差異表達(dá)miRNA，將2個(gè)文庫(kù)中的miRNA歸一化處理后進(jìn)行倍數(shù)變化值（fold change）和P值統(tǒng)計(jì)計(jì)算。篩選顯著性差異表達(dá)miRNA的具體標(biāo)準(zhǔn)為：①reads數(shù)大于 10；②∣log2（fold change）∣＞1；③P＜0.05。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用miScript SYBR Green PCR Kit檢測(cè)試劑盒分析miRNA的相對(duì)含量。按說(shuō)明書(shū)步驟，采用2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qPCR檢測(cè)。U6作為內(nèi)參，通過(guò)CT（2-ΔΔCt）方法分析miRNA的相對(duì)含量。

1.8 miRNA類(lèi)似物/抑制物及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

每孔取20 pmol miRNA類(lèi)似物/抑制物，稀釋于250 μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基中；按照樣品與轉(zhuǎn)染試劑為1∶3的比例將LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋于250 μL無(wú)血清1640培養(yǎng)基中，輕彈混勻，室溫靜置5 min后加入載體稀釋物中，輕彈混勻，室溫靜置20 min；將樣品-轉(zhuǎn)染試劑混合物逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后48 h提取總RNA。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作類(lèi)似，用量為1 μg/孔（24孔板）。

1.9 Starbase數(shù)據(jù)調(diào)取

選擇Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)（http://starbase.sysu.edu.cn/）中 miRNA-target interaction 板塊 miRNA-mRNA模塊，分析miR-19a-3p的靶基因。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用x±s表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析和方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑處理對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞活性的影響

10 μmol/L順鉑處理ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥細(xì)胞株和敏感株MCF7，MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果如圖1所示，耐藥株的細(xì)胞數(shù)量隨著處理時(shí)間的增加與敏感株相比逐漸增多（P＜0.001）。結(jié)果說(shuō)明乳腺癌耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑處理不敏感。

圖1 順鉑處理對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞活性的影響

2.2 篩選差異表達(dá)miRNA

RNA測(cè)序篩選ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥細(xì)胞株和敏感株差異表達(dá)的miRNA（圖2），發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p在耐藥株MCF7-CTRL和敏感株MCF7-RE中的表達(dá)差異最大，在耐藥株MCF7-RE中呈低表達(dá)。

圖2 RNA測(cè)序篩選差異表達(dá)基因

2.3 ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥細(xì)胞株和敏感株miR-19a-3p的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥株MCF7-RE和敏感株MCF7-CTRL中miR-19a-3p的含量，結(jié)果見(jiàn)圖3，miR-19a-3p在耐藥細(xì)胞株中的含量遠(yuǎn)低于敏感株（**P＜0.01）。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了RNA測(cè)序的篩選結(jié)果。

圖3 miR-19a-3p在ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥細(xì)胞株和敏感株中的表達(dá)量

2.4 miR-19a-3p過(guò)表達(dá)降低ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥株化療耐藥

合成miR-19a-3p類(lèi)似物和抑制物，分別轉(zhuǎn)染MCF7-RE和MCF7-CTRL（圖4A）。miR-19a-3p過(guò)表達(dá)可比較明顯地降低乳腺癌耐藥細(xì)胞株的耐藥濃度，增加對(duì)順鉑藥物的敏感度；同時(shí)，在敏感株中抑制miR-19a-3p的表達(dá)也反過(guò)來(lái)增加了敏感細(xì)胞株的藥物作用濃度（圖4B，P＜0.01）。該結(jié)果提示，miR-19a-3p負(fù)調(diào)控ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞順鉑耐藥。

圖4 miR-19a-3p影響ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的耐藥藥物濃度

2.5 miR-19a-3p負(fù)調(diào)控PIK3CB參與乳腺癌化療耐藥

我們對(duì)miR-19a-3p參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞順鉑敏感的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。通過(guò)Star?basev 2.0分析發(fā)現(xiàn)，在229例乳腺癌樣本中，癌基因PIK3CB（PI3K）是miR-19a-3p調(diào)控的靶標(biāo)基因，并且呈負(fù)相關(guān)（圖5A，r=-0.125 75）。PIK3CB是PI3K/Akt信號(hào)通路的重要組成成分之一，在腫瘤形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等。分別轉(zhuǎn)染miR-19a-3p類(lèi)似物和抑制物，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western印跡分別在RNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示miR-19a-3p能夠負(fù)調(diào)控PIK3CB（圖5B）。在乳腺癌耐藥細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染miR-19a-3p能夠明顯降低細(xì)胞的耐藥性，抑制其增殖；如果同時(shí)轉(zhuǎn)染PIK3CB表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，會(huì)部分減弱miR-19a-3p耐藥抑制的效應(yīng)（圖6）。

圖5 miR-19a-3p在乳腺癌細(xì)胞中靶向調(diào)控癌基因PIK3CB

圖6 miR-19a-3p負(fù)調(diào)控癌基因PIK3CB參與乳腺癌細(xì)胞化療耐藥

3 討論

目前乳腺癌的治療方式是以手術(shù)、內(nèi)分泌治療[6]、化療和靶向治療等多種手段結(jié)合的綜合治療[1]。研究表明，約70% 的乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)化療耐藥或在接受治療后很快出現(xiàn)化療耐藥[7-8]。無(wú)論是初始耐藥還是獲得性耐藥，都會(huì)影響乳腺癌患者的生活狀態(tài)和生存時(shí)間。

然而截至目前化療耐藥的機(jī)制并不十分清楚。大量研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可通過(guò)多種途徑發(fā)揮促癌或抑癌作用，這其中一些病理、生理過(guò)程與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)，可見(jiàn)miRNA也參與腫瘤化療耐藥的發(fā)生[2]。

我們通過(guò)RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在化療耐藥的ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞耐藥株和敏感株中，miR-19a-3p的含量差異顯著。通過(guò)qPCR對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌耐藥株和敏感株進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)miR-19a-3p在耐藥株中低表達(dá)。進(jìn)而初步分析miR-19a-3p負(fù)調(diào)控乳腺癌化療耐藥的機(jī)制，通過(guò)Starbase v2.0調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-19a-3p的相關(guān)數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)癌基因PIK3CB是miR-19a-3p的靶標(biāo)基因并呈負(fù)相關(guān)，后續(xù)我們證明miR-19a-3p的確能夠靶向PIK3CB并與乳腺癌細(xì)胞的順鉑耐藥相關(guān)。在回復(fù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，過(guò)表達(dá)PIK3CB能夠部分抵消miR-19a-3p的耐藥抑制性，一方面說(shuō)明miR-19a-3b/PIK3CB調(diào)控耐藥性的通路的確存在，另一方面說(shuō)明存在miR-19a-3p靶向其他潛在靶標(biāo)參與耐藥調(diào)控的可能性。由于miRNA作用靶標(biāo)眾多，具有多能性，我們后續(xù)的工作須擴(kuò)大篩選范圍，盡可能探索與描繪miR-19a-3p在乳腺癌中的功能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而不是局限于對(duì)PIK3CB的調(diào)控研究，這將有助于深入解析miR-19a-3p調(diào)控ER陽(yáng)性乳腺癌化療耐藥的機(jī)制，為臨床預(yù)防或治療ER陽(yáng)性乳腺癌提供新的靶點(diǎn)。