張 渝，朱小石，李運璧，陽 倩

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

侵襲性真菌(IFI)感染人體的方式是通過侵入人體內(nèi)部，在人體的組織器官以及血液中進(jìn)行生長繁殖，從而使組織受到損傷，并且引發(fā)炎癥反應(yīng)等多種疾病，這其中包括人體深部組織感染以及真菌性敗血癥。深部真菌感染已經(jīng)成為兒童及新生兒重癥監(jiān)護(hù)室院內(nèi)感染的常見原因，病死率和并發(fā)癥率極高，出生體重<1500克的早產(chǎn)兒病死率高達(dá)34%，在年長兒中的病死率也高達(dá)16%～28%。常見致病真菌有15種，致侵襲性真菌感染最常見的有5種，分別是白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌和克魯斯酵母菌[1～3]。其初始臨床表現(xiàn)較隱匿，缺乏特異性，容易延誤診斷及治療。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)以及鑒定需要耗費大量的時間，并且這種方法培養(yǎng)的真菌陽性率很低。1，3-β-D葡聚糖屬于真菌細(xì)胞壁中的主要組成成分，在真菌感染初始階段，其在血漿中水平會有一個明顯升高的趨勢，這對于侵襲性真菌感染的臨床診斷有很大的幫助[4]。1，3-β-D葡聚糖檢測(G實驗)已經(jīng)作為有臨床診斷意義的微生物學(xué)證據(jù)之一納入兒童侵襲性肺部真菌感染診治指南(2009版)[5]。本研究回顧性分析我院PICU侵襲性真菌感染在臨床上表現(xiàn)的特點，然后對侵襲性真菌感染患兒血漿中1，3-β-D葡聚糖含量進(jìn)行測定，接著在抗真菌治療期間動態(tài)檢測血漿1，3 -β-D葡聚糖變化，探討其對侵襲性真菌感染的早期診斷的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2012年1月至2018年1月本院PICU科收治的所有行G實驗檢查的IFI患兒。IFI 診斷標(biāo)準(zhǔn)按照中國侵襲性真菌感染工作組對侵襲性真菌感染的定義和分類進(jìn)行判斷[6]。①確診：通過組織病理學(xué)可以檢測組織內(nèi)部的真菌，然后通過無菌組織來培養(yǎng)上述發(fā)現(xiàn)的真菌；②臨床診斷：通過研究IFI的宿主以及環(huán)境因素，對真菌的臨床以及影像學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行研究，并且根據(jù)1項微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比；③擬診：研究得出該真菌中存在IFI宿主以及環(huán)境的原因，其次，也有臨床以及影像學(xué)表現(xiàn)，或者采用1項微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行衡量。按照IFI的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為IFI組和非IFI組，IFI組包括了確診、臨床診斷以及擬診IFI三個方面。并且，將G實驗真陽性為確診和臨床診斷組，排除擬診組。所有IFI組患兒均接受正規(guī)抗真菌治療，并于治療7天后復(fù)查G實驗。

1.2方法根據(jù)GKT-5 M真菌1，3-β-D葡聚糖檢測試劑盒中(北京金山川科技發(fā)展公司)說明書的具體實驗步驟操作，采用肝素鈉抗凝的采血管來量取靜脈血2 ml，然后在轉(zhuǎn)速為3000 r/min的環(huán)境下進(jìn)行離心操作，時間持續(xù)60秒，就可以得到含有較多血小板的血漿，然后量取0.1 ml的血漿在其中加入0.9 ml的樣品處理液，將其混合均勻，在70 ℃的環(huán)境下進(jìn)行保溫，時間持續(xù)10分鐘，然后將其取出，并且馬上放在冰水中進(jìn)行水浴，得到的液體就是待測血漿樣品。將上述液體量取0.2 ml，在其直接加入到酶反應(yīng)的主體之中，等到其完全溶解以后，將溶液加入到微量加樣器之中，并且加入到10 mm ×75 mm標(biāo)準(zhǔn)玻璃反應(yīng)管之中，將MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)插入，讓其開始反應(yīng)，等到反應(yīng)結(jié)束之后，就可以使儀器自動計算，如此就可以知道血漿中1，3-β-D葡聚糖水平如何，正常值<10 pg/ml。觀察PICU患兒發(fā)生侵襲性真菌感染的臨床特點，包括廣譜抗生素是否應(yīng)用，是否有持續(xù)長時間的機(jī)械通氣，皮質(zhì)激素是否使用，中心靜脈插管的時間長短以及全胃腸外營養(yǎng)(TPN)的時間有多久。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 19.0軟件來對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用配對t檢驗或t’檢驗。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對于G實驗得到的結(jié)果，即可以畫出受試者特征工作曲線(ROC曲線)，計算出曲線下面積。

2 結(jié)果

2.1PICU患兒IFI的總體分布特點本組有G實驗結(jié)果的患兒共169例，原發(fā)病及合并癥：膿毒癥、重癥肺炎、呼吸衰竭、支氣管肺發(fā)育不良(糾正胎齡大于40周由新生兒監(jiān)護(hù)室轉(zhuǎn)入PICU)、低血糖、電解質(zhì)紊亂、肺動脈高壓(PH)、顱內(nèi)出血、先天性心臟病、膈疝術(shù)后。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)診斷為IFI的患兒36例，其中確診9例，臨床診斷15例，擬診12例，排除IFI 133例。IFI發(fā)生率為1.45%。全部IFI組病例均行中心靜脈置管(PICC 28例，CVC置管8例)，均在診斷IFI前接受過>7天廣譜抗生素治療(頭孢三代或碳青霉烯類抗生素治療)。接受有創(chuàng)機(jī)械通氣治療27例(75%)，9例(25%)接受CPAP或鼻導(dǎo)管氧療。10例(27.78%)曾接受糖皮質(zhì)激素治療。全部病例TPN時間>3天，8例(22.22%)TPN時間>7天。9例確診患兒中血培養(yǎng)陽性8例，其中白色念珠菌感染為4例，2例為近平滑假絲酵母菌，2例為季也蒙念珠菌，1例為腦脊液墨汁染色鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌。白色念珠菌和季也蒙念珠菌均對氟康唑敏感，近平滑假絲酵母菌1例對氟康唑不敏感，但對兩性霉素B敏感。

2.2G實驗結(jié)果比較排除IFI組G實驗結(jié)果(16.82±25.65)pg/ml，IFI組G實驗結(jié)果(223.19±190.56)pg/ml，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t’ =-6.48，P< 0.05)。治療7天后IFI組G實驗結(jié)果為(33.91±25.63)pg/ml，與治療前IFI組G實驗結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.63，P< 0.05)。

2.3不同陽性值G試驗診斷患兒IFI的敏感度和特異度分別以10、15、20、25、30、40、50 pg/ml作為G實驗陽性值診斷兒童IFI的不同靈敏度和特異度，下表中可見以10或15 pg/ml作為陽性值，可以獲得非常滿意的靈敏度，但是特異度卻很差。而以20 pg/ml 作為陽性值可以獲得滿意的靈敏度(96%)和特異度(75%)，見表1。

表1 不同陽性值G 試驗診斷患兒IFI 的敏感度和特異度 (%)

2.4試驗診斷IFI的ROC曲線見圖 1。曲線下面積為0.882，P= 0.00，95%CI(0.757，1.000)。

圖1 試驗診斷IFI 的ROC 曲線

3 討論

隨著廣譜抗生素和全胃腸外營養(yǎng)的廣泛應(yīng)用以及侵入性操作的增加，重癥監(jiān)護(hù)病房真菌感染率呈日益增高趨勢。IFI已成為PICU 院內(nèi)感染的重要原因之一。除了真菌敗血癥這一病癥外，兒童以及新生兒的各個器官都有可能感染真菌，并且在呼吸道有關(guān)的肺炎中，很大一部分是由真菌感染導(dǎo)致的，此類肺炎一般病情重，發(fā)病時間短，發(fā)病速度很快，能夠看到很顯著的影像學(xué)的變化[7]。國內(nèi)外資料表明，深靜脈置管、廣譜抗生素的使用、氣管插管、靜脈脂肪乳輸注以及產(chǎn)前抗生素的使用是早產(chǎn)兒IFI的高危因素[7，8]。劉田田等[9]回顧性分析了104 例早產(chǎn)兒IFI的高危因素，發(fā)現(xiàn)低出生體重兒、夏秋冬季、廣譜抗生素、輔助通氣及胃腸道外營養(yǎng)等是早產(chǎn)兒真菌感染的高危因素。其中，輔助通氣及使用脂肪乳時間是真菌感染的獨立危險因素。兒童IFI的臨床表現(xiàn)隱匿，常以非特異性表現(xiàn)為主，然而在臨床表現(xiàn)上可能會有快速惡化的現(xiàn)象。了解IFI的高危因素，對高危兒加強監(jiān)測和防護(hù)，顯得尤為重要。

本研究發(fā)現(xiàn)，在IFI組，全部病例均行中心靜脈置管(PICC 28例，CVC置8例)，均在診斷IFI前接受過>7天廣譜抗生素治療(頭孢三代或碳青霉烯類抗生素治療)。接受有創(chuàng)機(jī)械通氣治療27例(75%)，10例(27.78%)曾接受糖皮質(zhì)激素治療。全部病例TPN時間>3天，8例(22.22%)TPN時間>7天。其高危因素與國內(nèi)外報道接近。

在真菌的細(xì)胞壁中，葡萄糖占據(jù)真菌質(zhì)量的比例達(dá)到80%～90%，其中1-3-β-D 葡聚糖的質(zhì)量占據(jù)真菌胞壁成分一半以上，特別是對于酵母樣真菌的體內(nèi)來說，含量會更加高[10]。當(dāng)真菌感染人體的血液或者人體的深部組織之中時，1-3-β-D 葡聚糖就會在細(xì)胞壁中脫離出來，引起血液中含量增高。本研究發(fā)現(xiàn)，IFI組治療前G實驗結(jié)果為(223.19±190.56)pg/ml，排除IFI組G實驗結(jié)果為(16.82±25.65)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療7天后IFI組的G實驗結(jié)果為(33.91±25.63)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表1顯示，以10或15 pg/ml作為陽性值，可以獲得非常滿意的靈敏度，但是特異度卻很差。而以20 pg/ml 作為陽性值可以獲得滿意的靈敏度(96%)和特異度(75%)。國內(nèi)報道1，3-β-D葡聚糖檢測不受內(nèi)毒素或抗生素的影響，靈敏度約90.0%，特異度100.0%[11]。本研究特異度不及其他研究高，即假陽性率稍高于其他研究，考慮可能與部分病例G實驗檢查前應(yīng)用靜脈丙種球蛋白(IVIG)或白蛋白有關(guān)。本研究制作的ROC曲線，曲線下面積為0.882，P= 0.00，95%CI(0.757，1.000)，說明G實驗診斷兒童IFI效果較好，有較高的準(zhǔn)確性。

PICU住院患兒，作為兒科特殊群體，因其原發(fā)病或并發(fā)癥原因，受到多種外因影響，使其成為IFI的易感人群。對易感兒早發(fā)現(xiàn)，早疑診，及時進(jìn)行必要的輔助檢查，提高早期診斷率，及時給予有效治療，以期有效降低病死率。同時，嚴(yán)格PICU管理和診療制度、操作的規(guī)范化，如減少侵襲性操作、早期微量胃腸內(nèi)喂養(yǎng)、提高PICU病房內(nèi)嬰兒母乳喂養(yǎng)率等也是防止真菌性院內(nèi)感染的有效方法。

G實驗是早期診斷IFI 的有效檢測手段之一，將大幅度提前抗真菌治療的時間，標(biāo)本采取方法及檢測方法較為方便快捷，具有很大的臨床應(yīng)用價值。本研究發(fā)現(xiàn)，使用20 pg/ml作為G實驗的陽性界值，可以獲得滿意的靈敏度和特異度。