曹立雪

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與發(fā)育生物學(xué)系，北京 100069)

北京時(shí)間2018年10月3日下午5時(shí)45分(當(dāng)?shù)貢r(shí)間上午11時(shí)45分)瑞典皇家科學(xué)院宣布將2018年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予弗朗西絲·阿諾德(美國(guó))、喬治·史密斯教授(美國(guó))和格雷戈里·溫特爵士(英國(guó))，以表彰他們?cè)诿傅亩ㄏ蜻M(jìn)化和多肽(抗體)的噬菌體展示技術(shù)研究方面的杰出貢獻(xiàn)。弗朗西絲·阿諾德因研究酶的定向進(jìn)化而分享一半獎(jiǎng)金。喬治·史密斯和格雷戈里·溫特因研究多肽和抗體的噬菌體展示技術(shù)而共享另一半獎(jiǎng)金(圖1)。

1 獲獎(jiǎng)?wù)吆?jiǎn)介

弗朗西絲·阿諾德(Frances H. Arnold)于1956年出生在美國(guó)匹茲堡，1985年從加州大學(xué)伯克利分校(University of Calforni，Berkeley，USA)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)為加州理工學(xué)院化學(xué)工程、生物工程和生物化學(xué)系教授。1993年,她首次進(jìn)行了酶的定向進(jìn)化，酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。此后，她改進(jìn)了當(dāng)時(shí)用于開發(fā)新型催化劑的常規(guī)方法。弗朗西絲·阿諾德獲取了一系列性能優(yōu)良、對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害的酶，被應(yīng)用于制藥行業(yè)和生物燃料等領(lǐng)域。

喬治·史密斯(George P. Smith)于1941年出生在美國(guó)康涅狄克州諾瓦克，1970年從哈佛大學(xué)(Harvard University, Cambridge, USA)獲得博士學(xué)位，現(xiàn)為密蘇里大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院榮譽(yù)教授。1985年，喬治·史密斯發(fā)明了一種被稱為噬菌體展示技術(shù)的方法，噬菌體(一種感染細(xì)菌的病毒)可用于進(jìn)化新的蛋白質(zhì)。

格雷戈里·溫特(Gregory P. Winter)爵士1951年出生于英國(guó)萊斯特，1976年獲得英國(guó)劍橋大學(xué)(University of Cambridge, UK)博士學(xué)位，現(xiàn)為劍橋大學(xué)MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室榮譽(yù)研究負(fù)責(zé)人。格雷戈里·溫特爵士利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體的定向進(jìn)化，目的是生產(chǎn)新的藥物，2002年第一種基于這種方法生產(chǎn)的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和炎性腸病的新藥——阿達(dá)木單抗(Adalimumab)獲得批準(zhǔn)上市，從那以后，噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)出了可以中和毒素、抵抗自身免疫性疾病和治療轉(zhuǎn)移性癌癥的抗體。

圖1 2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者[1]Fig.1 Laureates of the Nobel Prize in Chemistry 2018

2 酶和結(jié)合蛋白的定向進(jìn)化

在我們生活的星球上有一種神奇而強(qiáng)大的力量伴隨著生命的發(fā)生和繁榮——進(jìn)化。自37億年前地球上出現(xiàn)首批生命以來(lái)，幾乎每寸地表中都填滿了不斷對(duì)環(huán)境做出適應(yīng)的生命體，比如生長(zhǎng)在貧瘠山脊上的地衣，在熱泉中頑強(qiáng)生存的藻類，干燥沙漠中渾身披甲的爬行動(dòng)物，以及在黑暗的深海中閃閃發(fā)光的水母。地球上的生物之所以能存活下去，是因?yàn)檫M(jìn)化幫它們解決了無(wú)數(shù)復(fù)雜的化學(xué)問(wèn)題。所有生物都可以從周邊環(huán)境中提取可用的物質(zhì)和能量，用它們合成自己所需的獨(dú)特化學(xué)成分。魚的血液中含有防凍蛋白質(zhì)，因此它們?cè)跇O地冰洋中也能暢游無(wú)阻；貝類能分泌一種水下分子膠，因此可以牢牢粘附在巖石上。這些化學(xué)反應(yīng)的絕妙之處在于，它們已經(jīng)被編寫進(jìn)了我們的基因中，能夠代代相傳、不斷演變?；蛉绻l(fā)生了一點(diǎn)兒意外變化，就會(huì)改變這種化學(xué)反應(yīng)。有時(shí)這會(huì)削弱生物體的生存能力，有時(shí)則會(huì)讓該生物變得更加強(qiáng)大。隨著新的化學(xué)反應(yīng)逐漸出現(xiàn)，地球上的生命也變得愈加復(fù)雜。

自地球上的生命出現(xiàn)以來(lái)，酶的自然進(jìn)化就已經(jīng)存在。基因的突變和蛋白質(zhì)進(jìn)化提高了機(jī)體應(yīng)對(duì)在新的環(huán)境條件下的適應(yīng)性。幾千年來(lái)，人類通過(guò)選擇具有所需特性的生物來(lái)繁殖動(dòng)物和植物。人類已經(jīng)在定向進(jìn)化和優(yōu)化酶及結(jié)合蛋白，但是在大部分時(shí)間里，人們甚至不知道自己在做什么。酶和結(jié)合蛋白的定向進(jìn)化是建立在分子眼光基礎(chǔ)上的人造程序，它將進(jìn)化過(guò)程轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室并加速進(jìn)化， 該方法依賴于在確定的隨機(jī)性水平下蛋白質(zhì)序列的預(yù)期變異與工程篩選及選擇策略相結(jié)合。

1984年，Manfred Eigen發(fā)表了一篇理論論文[2]，概述了酶的定向進(jìn)化的可能工作流程。 他認(rèn)為在大型突變體文庫(kù)中尋找罕見的改進(jìn)型突變體即使不是不可能，也很難。在Eigen的理論工作之后的十年，F(xiàn)rances H. Arnold第一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中成功實(shí)施酶的定向進(jìn)化以改進(jìn)酶的功能[3]。 Frances H. Arnold報(bào)道了枯草桿菌蛋白酶E在高度非天然(變性)環(huán)境中的定向進(jìn)化，即在高濃度的極性有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺(DMF)中獲得有活性的酶突變體。在DMF存在下進(jìn)行連續(xù)四輪的誘變和篩選后，在60%(體積分?jǐn)?shù))DMF中產(chǎn)生了比野生型酶高256倍活性的酶變體[3-4]。在她的開創(chuàng)性論文[3]中，阿諾德掌握了酶的定向進(jìn)化的整個(gè)工作流程(圖2)，這是一種依賴于以下幾個(gè)步驟的方法：①為所選任務(wù)確定合適的起始酶；②構(gòu)建涵蓋所選序列空間子集的DNA序列文庫(kù)；③建立通過(guò)優(yōu)化酶突變體實(shí)現(xiàn)功能強(qiáng)化或產(chǎn)生新功能和方法的標(biāo)準(zhǔn)；④通過(guò)基因的重排以覆蓋第一輪選擇序列，從而創(chuàng)建新的DNA序列文庫(kù)的新子集；⑤設(shè)置更嚴(yán)格的選擇標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)多輪次篩選以達(dá)到酶性能的目標(biāo)水平。多年來(lái)，這五個(gè)步驟中的每一步都在阿諾德實(shí)驗(yàn)室和其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中得到了進(jìn)一步的發(fā)展和優(yōu)化。

圖2 酶定向進(jìn)化的基本原理[1]Fig.2 The underlying principle for the directed evolution of enzymesAfter a few cycles of directed evolution, an enzyme may be several thousand times more effective.

1)隨機(jī)突變是隨機(jī)引入基因的，這種酶最終會(huì)發(fā)生改變；2)這些基因被插入細(xì)菌之中，細(xì)菌將它們作為模板，隨機(jī)性制造突變酶；3)這種改變的酶物質(zhì)經(jīng)過(guò)測(cè)試，篩選出最有效催化所需化學(xué)反應(yīng)的酶。4)新的隨機(jī)突變被引入到被篩選出的酶中開始新一輪進(jìn)化。經(jīng)過(guò)幾個(gè)周期的定向進(jìn)化之后，一種酶的效率可能會(huì)提高幾千倍。

此外，F(xiàn)rances H. Arnold 第一次[3]使用易錯(cuò)(error-prone )PCR來(lái)創(chuàng)建和重新分化一個(gè)由四個(gè)單突變組合形成的DNA序列文庫(kù)，通過(guò)三輪隨機(jī)誘變和篩選，進(jìn)化枯草桿菌蛋白酶E。選擇標(biāo)準(zhǔn)是乳蛋白酪蛋白的水解。 活性酶突變體在含有酪蛋白的瓊脂平板上產(chǎn)生可見光暈。 因此將細(xì)菌菌落分泌的酶轉(zhuǎn)移到含有DMF和酪蛋白的瓊脂平板上，以便鑒定能夠在有機(jī)溶劑存在下活性最高的酶突變體。酶突變體產(chǎn)生比親本酶周圍的暈圈更大的暈圈，從所述酶變體的克隆中分離質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行進(jìn)一步的誘變循環(huán)。枯草桿菌蛋白酶E的定向進(jìn)化，改善了其在極性有機(jī)溶劑中的活性是開啟酶的定向進(jìn)化領(lǐng)域的基準(zhǔn)成就。 這項(xiàng)工作成為定向進(jìn)化方法持續(xù)發(fā)展的起點(diǎn)。 該領(lǐng)域擴(kuò)展到可改善和重塑各種新舊化學(xué)反應(yīng)的酶[5-6]， 對(duì)有機(jī)合成研究以及化學(xué)和制藥工業(yè)及其他領(lǐng)域的研究具有重要意義。

酶通常具有200～300個(gè)氨基酸殘基或更多，不可能隨機(jī)突變酶中的每個(gè)位置。 事實(shí)上，如果靶標(biāo)是具有完整序列覆蓋的文庫(kù)，則只有一小部分氨基酸位置可以變化。 Arnold及其同事已經(jīng)通過(guò)許多實(shí)例證明，文庫(kù)設(shè)計(jì)必須基于對(duì)分子的洞察和知識(shí)的積累來(lái)選擇氨基酸變化的位置并且通過(guò)易錯(cuò)PCR隨機(jī)的添加元件。

開發(fā)和實(shí)施定向進(jìn)化方法的一個(gè)突出的早期貢獻(xiàn)者是已故的William P. Stemmer(1957-2013)。 Stemmer為酶的進(jìn)化引入了一種稱為“DNA重排”的DNA重組策略。這是一種來(lái)增加有益突變的有效方法，同時(shí)通過(guò)隨機(jī)片段化和基因重組來(lái)增加DNA文庫(kù)的大小[7-8]。他指出使用DNA重排，即來(lái)自幾種生物的相似基因的DNA重組，可以引入比許多其他方法更多的變異，因此可以提高進(jìn)化突變體達(dá)到預(yù)期活性的機(jī)會(huì)。在原理論證研究中，Stemmer和同事在具有連續(xù)更高濃度的抗生素頭孢噻肟的平板上，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶(一種負(fù)責(zé)抗生素抗性的酶) 進(jìn)行三次DNA重組和篩選，使酶的活性顯著增加[7-8]?；蛑嘏攀窃黾涌贵w多樣性和提高靶標(biāo)抗體親和力的一種手段，有時(shí)稱為親和力成熟，并提供了結(jié)合蛋白定向進(jìn)化的早期實(shí)例[9-10]。在這些情況下，重排的基因區(qū)段對(duì)應(yīng)于輕鏈[11]或免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變環(huán)[9-10]。在20世紀(jì)90年代后半期，Arnold和Stemmer的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步開發(fā)DNA重排，交錯(cuò)延伸過(guò)程(StEP)和其他文庫(kù)生成方法，用于 進(jìn)行酶的定向進(jìn)化。自20世紀(jì)末以來(lái)，由于基因從頭合成成本的降低，研究人員可以通過(guò)簡(jiǎn)并密碼子或完全設(shè)計(jì)的基因從頭合成來(lái)定制多樣性序列文庫(kù)。 基因重排和分子設(shè)計(jì)為進(jìn)化提供了可用的素材，選擇為定向進(jìn)化確定方向。

DNA工具自20世紀(jì)90年代以來(lái)一直在不斷改良，定向進(jìn)化方法也比從前多了幾倍。弗朗西絲·阿諾德一直走在這些發(fā)展的前列。她所在的實(shí)驗(yàn)室制造的酶甚至能夠催化自然界中不存在的化學(xué)反應(yīng)，從而制造出全新的材料。經(jīng)她“量身定做”的酶已經(jīng)成為了多種物質(zhì)的重要生產(chǎn)工具，如藥物生產(chǎn)等。利用這些酶，化學(xué)反應(yīng)速度得以大大提高，副產(chǎn)物也明顯減少，在有些情況下，還能杜絕傳統(tǒng)化學(xué)反應(yīng)中重金屬的使用，因此顯著減小了對(duì)環(huán)境的影響。

事情總會(huì)不斷循環(huán)，弗朗西絲·阿諾德如今又開始了對(duì)可再生能源生產(chǎn)的研究。她的研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)了幾種酶，能夠把簡(jiǎn)單的糖類轉(zhuǎn)化成異丁醇。這種物質(zhì)富含能量，可用于生產(chǎn)生物燃料和環(huán)保塑料。他們的長(zhǎng)期目標(biāo)之一是，通過(guò)生產(chǎn)更環(huán)保的燃料，打造更有利于環(huán)境的交通運(yùn)輸行業(yè)。通過(guò)應(yīng)用阿諾德研發(fā)的酶制造的其他燃料還可用在小驕車和航天飛機(jī)上。由此看來(lái)，她研發(fā)的酶對(duì)更加綠色環(huán)保的世界做出了卓越貢獻(xiàn)。

3 噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是一項(xiàng)由George P. Smith開發(fā)的重大突破技術(shù)[12]。 編碼特定蛋白質(zhì)成員的DNA插入到噬菌體表面蛋白的基因中，以在其表面呈遞蛋白質(zhì)的方式包裝在噬菌體內(nèi)。 這簡(jiǎn)化了基于與受體結(jié)合的篩選， 也簡(jiǎn)化了展示最佳結(jié)合蛋白的噬菌體的鑒定和擴(kuò)增。 大腸桿菌噬菌體的感染和在宿主中的增生在每輪選擇后產(chǎn)生富集的文庫(kù)。 還可以在選擇輪次之間重新分散噬菌體文庫(kù)(圖3)。

George P. Smith在其開創(chuàng)性的論文[12]中證明，多肽可以插入融合噬菌體表面的次要外殼蛋白III中，這種噬菌體展示的多肽保留了與其靶標(biāo)的相互作用。 在這項(xiàng)工作中，噬菌體展示的多肽是限制性內(nèi)切核酸酶的57個(gè)氨基酸殘基的片段。使用單輪親和純化與內(nèi)切核酸酶的抗血清，可以將內(nèi)切核酸酶多肽插入噬菌體表面的外殼蛋白III中表達(dá)的噬菌體富集1 000倍。他還預(yù)測(cè)，使用抗體作為誘餌進(jìn)行親和純化，可以從噬菌體載體中的隨機(jī)插入文庫(kù)中分離克隆[12]。在另一篇文章[13]中，Parmley和Smith闡述了他們從1)史密斯在噬菌體外殼蛋白中引入一種基因，之后將噬菌體DNA插入細(xì)菌體內(nèi)；2)從引入基因編碼的肽可作為噬菌體外殼蛋白的一部分展示在噬菌體表面；3)史密斯能夠用已知的抗體將含有特定多肽抗原的噬菌體釣出，從而獲得了多肽的基因。

圖3 噬菌體展示——這是喬治·史密斯開發(fā)的一種基于已知蛋白質(zhì)尋找未知基因的方法[1]Fig.3 Phage display-George Smith developed this method for finding unknowns genes for a known protein

1988年開始，對(duì)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行了幾項(xiàng)技術(shù)改進(jìn)，例如，改變展示多肽在蛋白質(zhì)III中的位置。 這是由于蛋白質(zhì)III通過(guò)與其F菌毛結(jié)合而介導(dǎo)大腸桿菌感染， 因此，全功能蛋白III對(duì)于噬菌體的繁殖是必需的。Smith使用與生物素化靶標(biāo)偶聯(lián)的鏈霉親和素蛋白包被的培養(yǎng)皿，從較低親和力的背景中親和純化展示高親和力多肽的噬菌體，稱為“生物淘洗”(biopanning)，為親和純化過(guò)程中捕獲、洗滌和洗脫展示高親和力多肽的噬菌體提供了簡(jiǎn)便的方法。史密斯通過(guò)對(duì)其靶標(biāo)進(jìn)行親和純化，實(shí)現(xiàn)了108倍富集展示代表抗β-半乳糖苷酶抗體表位的肽的噬菌體，顯示了其改進(jìn)方法的可行性。兩篇論文同時(shí)發(fā)表在同一期Science上[14-15]。 兩個(gè)文庫(kù)都與外殼蛋白III融合表達(dá)。 Devlin及其同事報(bào)道了一個(gè)包含2 000萬(wàn)種不同15聚體肽的文庫(kù)，用于推斷肽結(jié)合基序HPQ，它賦予鏈霉親和素生物素結(jié)合位點(diǎn)高親和力[14]。

Scott和Smith報(bào)道了一個(gè)包含4 000萬(wàn)個(gè)6聚體肽的文庫(kù)，用于確定兩種不同單克隆抗體的表位，這些抗體是針對(duì)肌紅蛋白的六殘基片段而產(chǎn)生的[15]。 通過(guò)連續(xù)三輪生物淘洗從文庫(kù)中親和純化抗體結(jié)合肽，然后感染大腸桿菌以產(chǎn)生用于下一輪的富集噬菌體展示文庫(kù)。 經(jīng)過(guò)三輪親和純化，結(jié)合對(duì)所選克隆的親和力測(cè)量，Smith和同事只保留了最高親和力的多肽，可以基于單個(gè)克隆的DNA測(cè)序推斷抗體表位的共有結(jié)合基序[15]。 通過(guò)比較大量的氨基酸序列，他們發(fā)現(xiàn)表位的前3個(gè)氨基酸對(duì)于抗體的高親和力結(jié)合是最重要的[15]。

4 噬菌體展示抗體

1990年，Gregory P. Winter爵士報(bào)告了在絲狀噬菌體上展示折疊且功能完整的抗體片段[16]。 完整IgG是由多于一個(gè)氨基酸鏈組成的大的二價(jià)分子，因此難以在噬菌體表面上表達(dá)。 Winter和同事展示了單鏈可變片段scFv，其中重鏈的可變部分通過(guò)柔性多肽接頭與輕鏈共價(jià)連接[17]。 因此，scFv攜帶由6個(gè)可變環(huán)組成的單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，即所謂的互補(bǔ)限定區(qū)(CDR)。Winter概述了抗體噬菌體展示的幾個(gè)未來(lái)方向和應(yīng)用[16]。 他提出構(gòu)建和篩選由重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的基因的隨機(jī)組合產(chǎn)生的抗體文庫(kù)，可以在絲狀噬菌體上展示。 他還提出在噬菌體上生產(chǎn)和篩選全合成抗體文庫(kù)。Richard Lerner及其同事在1991年報(bào)道了抗體片段的噬菌體展示的另一個(gè)例子[18]，在這種情況下，沿著噬菌體表面的整個(gè)長(zhǎng)度，與主要外殼蛋白VIII融合。 這項(xiàng)工作展示了一些較大的抗體片段，即所謂的Fab片段，來(lái)源于小鼠抗破傷風(fēng)毒素，抗體重鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域顯示在噬菌體上，抗體輕鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域以分泌形式表達(dá)。 來(lái)自兩條鏈的片段在噬菌體表面上重建Fab，并且使用生物淘洗實(shí)現(xiàn)了超過(guò)非特異性噬菌體的2 700倍富集; 研究人員提出，使用連續(xù)輪次的生物淘洗會(huì)產(chǎn)生更高的富集[18]。

1991年，有研究[9]報(bào)告了在絲狀噬菌體上展示的許多抗體文庫(kù)。這項(xiàng)工作在幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室中同時(shí)進(jìn)行，包括Winter和Lerner實(shí)驗(yàn)室。第一份報(bào)告描述了scFv抗體片段文庫(kù)的噬菌體展示[9]。該文庫(kù)來(lái)源于用小分子抗原2-苯基惡唑-5-酮(phOx)免疫的小鼠，并展示在絲狀噬菌體的蛋白質(zhì)III的N-末端。使用固定在柱樹脂上的phOx抗原， 有可能從初始文庫(kù)中選擇phOx結(jié)合抗體，并且在連續(xù)幾輪選擇中高親和力抗體的比例增加。此外，他們發(fā)現(xiàn)，如果可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)基因在親和選擇輪次之間重新組合以產(chǎn)生免疫小鼠中不存在的新組合，則可以得到更高親和力的抗體[9]，包含200 000個(gè)scFv序列的原始文庫(kù)，但在重新調(diào)整VH和VL基因后，這文庫(kù)增加到4 000萬(wàn)個(gè)序列，并且回收了更多數(shù)量的高親和力phOx結(jié)合物。

用于從噬菌體展示文庫(kù)中選擇結(jié)合肽或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法原則上與經(jīng)典親和純化相同;對(duì)靶標(biāo)具有最高親和力的文庫(kù)中的那些個(gè)體被捕獲在固體支持物上，然后進(jìn)行多次和大量的洗滌步驟，然后用酸洗脫最佳結(jié)合肽及其連接的噬菌體，中和并用于感染大腸桿菌以產(chǎn)生豐富的文庫(kù)。因此，富集的文庫(kù)中包含許多高親和力多肽的拷貝，而較低親和力多肽的拷貝數(shù)很低。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)幾次，并通過(guò)降低所用靶標(biāo)的量連續(xù)增加選擇的嚴(yán)格性，獲得更高親和力的多肽。噬菌體展示的多肽和蛋白質(zhì)的選擇通常使用固定在色譜樹脂、培養(yǎng)皿、磁珠或其他支持物上的靶標(biāo)進(jìn)行。然而，在細(xì)胞展示的情況下，更常見的是使用流式細(xì)胞術(shù)，這種結(jié)合可以和熒光讀數(shù)耦合。通過(guò)仔細(xì)選擇孵育和洗滌時(shí)間，可以將選擇策略基于目標(biāo)和文庫(kù)成員之間的關(guān)聯(lián)或解離速率，而不是基于親和力。 通過(guò)調(diào)用某種選擇壓力，如升高的溫度或蛋白酶的存在，噬菌體展示可用于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(圖4)。

格雷戈里·溫特和同事們創(chuàng)立了一家基于抗體噬菌體展示技術(shù)的公司。在1990年代，這家公司開發(fā)出一種新藥，其完全基于一種人類抗體：“阿達(dá)木單抗”(adalimumab)。這種抗體能夠中和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，這種蛋白質(zhì)在許多自身免疫疾病中引發(fā)炎性反應(yīng)。在2002年，這種藥物被批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，而現(xiàn)在這種藥物更是被應(yīng)用于不同類型的牛皮癬以及炎性腸道疾病的治療?！鞍⑦_(dá)木單抗”的成功在制藥行業(yè)掀起波瀾，噬菌體展示技術(shù)被很快應(yīng)用于生產(chǎn)癌癥抗體和其他藥物，其中有一種藥物能夠釋放人體自然殺傷細(xì)胞，以便后者去對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)起攻擊。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)將被遲滯，甚至在某些案例中，成功治愈了患有轉(zhuǎn)移性腫瘤的患者，這在腫瘤治療史上是一項(xiàng)重要的成就。另一種已經(jīng)被批準(zhǔn)的抗體藥物則可以被用于中和引發(fā)炭疽的細(xì)菌性毒素，還有一種藥物可以緩解某些自身免疫疾病，如狼瘡，還有更多的類似藥物正處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，其中包括對(duì)抗阿爾茨海默癥的藥物。

5 應(yīng)用前景

酶的定向進(jìn)化已成為生物催化劑開發(fā)的高效方案，具有高特異性，有限的副反應(yīng)和對(duì)不同反應(yīng)條件的耐受性。 定向進(jìn)化是一種通用且有效的途徑，可以生產(chǎn)具有新功能的酶和功能優(yōu)化的酶。 從定向進(jìn)化研究中得出的一個(gè)主要結(jié)論是酶確實(shí)可以被調(diào)節(jié)以催化新反應(yīng)，并且反應(yīng)與自然界自身酶催化的反應(yīng)非常不同。 在反應(yīng)性、底物特異性和化學(xué)反應(yīng)以及對(duì)各種反應(yīng)條件的耐受性方面，存在充分的空間用于酶功能的優(yōu)化和重定向。 我們可能與酶催化反應(yīng)的極限相距甚遠(yuǎn)——還有很大空間進(jìn)一步發(fā)展。

結(jié)合蛋白的定向進(jìn)化已成為用于開發(fā)治療性抗體的高效方案。多肽和抗體的噬菌體展示用于衍生對(duì)給定靶標(biāo)具有高親和力的突變體，并提供關(guān)于結(jié)合反應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性的親和力和特異性的序列要求和分子驅(qū)動(dòng)力的有價(jià)值信息。在過(guò)去的25年中，已經(jīng)使用定向進(jìn)化以改善結(jié)合親和力，同時(shí)保留抗體的高選擇性。這種“親和力成熟”方法得到的抗體在1012～1015M-1范圍內(nèi)對(duì)其抗原具有親和力，相對(duì)于免疫產(chǎn)生的抗體， 從噬菌體展示文庫(kù)中提出的抗體親和力提高了數(shù)千至數(shù)百萬(wàn)倍。這種非常高的親和力使得它們可以用作皮下自給藥治療劑，而不需要在醫(yī)生辦公室中在靜脈內(nèi)注射更大量的治療劑。目前，科研人員已經(jīng)使用噬菌體展示技術(shù)鑒定一系列人抗體，并且在臨床上用于炎性疾病和癌癥的治療。

圖4 利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行抗體定向進(jìn)化的原理，該方法可以用于生產(chǎn)新的藥物[1]Fig.4 The principle for the directed evolution of antibodies using phage display，This method was used to produce new pharmaceuticals

1)抗體結(jié)合位點(diǎn)的遺傳信息被插入到噬菌體DNA之中。此后可用于創(chuàng)建一個(gè)具有多樣性的抗體庫(kù)；2)通過(guò)靶抗原篩選出對(duì)特定抗原具有強(qiáng)附著性的噬菌體；3)在進(jìn)行另一輪選擇之前，將隨機(jī)突變引入附著在目標(biāo)抗體的噬菌體上；4)隨著新一代抗體的出現(xiàn)，抗體會(huì)更特異地、更加強(qiáng)烈地附著在目標(biāo)蛋白質(zhì)上。

2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)人所引入的方法已經(jīng)在全球廣泛應(yīng)用，它讓化學(xué)工業(yè)變得更加綠色環(huán)保，幫助產(chǎn)生新的物質(zhì)，生產(chǎn)數(shù)量可觀的生物燃料，消除疾病，拯救生命。酶的定向進(jìn)化以及抗體的噬菌體展示技術(shù)，讓今年的3位獲獎(jiǎng)人——弗朗西絲·阿諾德、喬治·史密斯以及格雷戈里·溫特爵士得以幫助人類社會(huì)創(chuàng)造最大福祉，并為化學(xué)領(lǐng)域的一場(chǎng)深刻革命奠定了基礎(chǔ)。