柳 鑫 段 華 成九梅 陳 芳 徐 倩

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心， 北京 100006)

子宮內(nèi)膜是由多種細(xì)胞成分組成的組織，子宮內(nèi)膜經(jīng)過(guò)重復(fù)的循環(huán)過(guò)程，包括增生、蛻膜化、剝脫與修復(fù)。如果子宮內(nèi)膜在上述生理過(guò)程被干擾或破壞，尤其子宮內(nèi)膜基底層如被感染或機(jī)械損傷，會(huì)發(fā)生宮腔粘連(intrauterine adhesion，IUA)[1]。宮腔粘連形成后會(huì)導(dǎo)致月經(jīng)量減少、流產(chǎn)、胎盤(pán)置入等不良結(jié)局，進(jìn)而嚴(yán)重影響人類(lèi)生殖健康。目前，針對(duì)重度宮腔粘連性疾病尚沒(méi)有能夠改善生育功能和月經(jīng)生理的有效治療方案。近年來(lái)應(yīng)用芯片技術(shù)篩查組織及細(xì)胞中mRNA表達(dá)譜、驗(yàn)證及鑒定其靶基因并進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)方法得到廣泛應(yīng)用。本研究進(jìn)行了重度宮腔粘連組織的mRNA表達(dá)譜芯片分析，找到了與正常子宮組織相比差異表達(dá)的mRNA，聯(lián)合生物信息學(xué)分析工具和數(shù)據(jù)庫(kù)，從分子水平探討宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制，為明確宮腔粘連發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及處理

IUA組：重度宮腔粘連組織13例，均選自年齡30～40歲、月經(jīng)周期處于增生早期的重度宮腔粘連患者。于宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)中切除粘連組織，剪去周?chē)须姄p傷的部分，約5 mm3大小，于液氮中保存。對(duì)照組：正常子宮組織13例，均選自年齡40～45歲、月經(jīng)周期處于增生早期的子宮肌瘤患者。于子宮全切術(shù)后留取正常子宮組織，包括子宮內(nèi)膜及部分子宮淺肌層組織，約5 mm3大小，于液氮罐中保存。所有患者無(wú)其他基礎(chǔ)疾病，術(shù)前未用藥物治療。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意備案，簽署知情同意書(shū)。

1.2 RNA提取與芯片實(shí)驗(yàn)

組織中RNA的提?。喝〕鰳悠方鈨鰳?biāo)本，按照Trizol一步法提取總RNA，每個(gè)樣品吸取 1 μL，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA 溶液在 260 nm 和 280 nm 下的吸光度值，檢測(cè) RNA 的濃度和純度。吸光度值260 nm/280 nm值在 1.9～2.1之間時(shí)，可認(rèn)為RNA 的純度較好，備實(shí)驗(yàn)用。

芯片實(shí)驗(yàn)：IUA組和對(duì)照組各3例標(biāo)本分別提取總RNA，并行定量、質(zhì)檢，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，對(duì)每一例標(biāo)本分別進(jìn)行Affymetrix Human Gene 1.0芯片(美國(guó)Affymetrix公司)分析，共使用6張芯片，包括樣本標(biāo)記、雜交、洗滌、掃描。獲取重度宮腔粘連組織差異mRNA表達(dá)譜。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.1 差異篩選

在研究?jī)山M樣本差異時(shí)，把差異基因作為研究對(duì)象，進(jìn)一步的研究，由于芯片檢測(cè)過(guò)程中，每組僅有3張芯片，屬于小樣本數(shù)據(jù)(小于30)，為了減少小樣本造成的差異篩選誤差，利用隨機(jī)方差模型修正的t檢驗(yàn)對(duì)兩組進(jìn)行比較，計(jì)算基因間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而得到差異的基因[2]。

1.3.2 差異基因的功能分析(GO-analysis)

GO analysis方法將兩組之間的差異基因基于GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋?zhuān)玫交騾⑴c的所有功能，而后利用Fisher精確檢驗(yàn)和多重比較檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)功能的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而篩選出差異基因所體現(xiàn)的顯著性功能，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.3 差異基因參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析

基于京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，對(duì)差異基因利用Fisher精確檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，把目標(biāo)基因參與的通路進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05進(jìn)行篩選，得到顯著性的通路。

2 結(jié)果

2.1 RNA質(zhì)量

臨床組織標(biāo)本提取總的RNA在3.765～31.62 μg 之間，吸光度值260 nm/280 nm比值在1.87～2.1之間。

2.2 差異基因的篩選

應(yīng)用6張Affymetrix Human Gene 1.0芯片，比較3例IUA組織與3例對(duì)照組正常子宮組織的mRNA表達(dá)情況，篩選出1 425個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因731個(gè)，下調(diào)基因694個(gè)。

2.3 差異基因主要的生物學(xué)功能

顯著性功能分析結(jié)果包括有：信號(hào)傳導(dǎo)、多種細(xì)胞有機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞粘連、細(xì)胞分化、單核細(xì)胞活化等，詳見(jiàn)表1。

2.4 上調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

上調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括Wnt信號(hào)通路和黏附連接通路、細(xì)胞粘連分子通路、整合素調(diào)節(jié)通路、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路等，詳見(jiàn)表2。

2.5 下調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

下調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括：MAPK信號(hào)通路、焦點(diǎn)連接、TGF-b信號(hào)通路、縫隙連接等，詳見(jiàn)表3。

2.6 Real-time熒光定量PCR驗(yàn)證

擴(kuò)大各組樣本各10例，選取部分目標(biāo)基因mRNA即：LOX、ADAM9、CDH2、COL16A1應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行驗(yàn)證，研究組與正常組相比，重度宮腔粘連組：LOX下調(diào)(0.53±0.06)倍，ADAM9下調(diào)(0.67±0.03)倍，CDH2上調(diào)(5.19±0.46)倍， COL16A1上調(diào)(2.04±0.31)倍。RT-PCR的結(jié)果與基因芯片結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致，IUA組與正常子宮組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

表1 差異基因主要的生物學(xué)功能Tab.1 Main biological function of differently expressed gene

表2 上調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Tab.2 Signal pathway of up-regulated gene participating

TGF：transforming growth factor.

3 討論

宮腔粘連是由各種原因?qū)е碌淖訉m內(nèi)膜纖維化及瘢痕化、不同程度的內(nèi)膜缺失、內(nèi)膜變薄、增生及分泌不足、子宮前后壁粘連、宮腔容積縮小等病理改變。重度宮腔粘連的治療依舊是臨床的難點(diǎn)[3-5]。有研究[6]表明宮腔粘連患者子宮肌壁的纖維組織成分占50%～80%，而正常子宮纖維成分僅為13%～20%。子宮瘢痕收縮或?qū)m腔形成粘連造成子宮硬化、宮腔容積縮小及宮腔解剖結(jié)構(gòu)異常，影響子宮月經(jīng)及妊娠功能。而解決宮腔狹窄、子宮硬化及宮腔異常解剖的關(guān)鍵是在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分子水平上闡明如何調(diào)控肉芽組織中膠原的合成與分泌，以及如何加速瘢痕中膠原的分解與吸收[7]。經(jīng)篩選，本課題組得到重度宮腔粘連組織相關(guān)基因的主要功能及其所在有顯著差異的通路，并找到部分參與瘢痕修復(fù)中膠原沉積及組織重構(gòu)過(guò)程中起作用的基因，據(jù)此推斷這些基因參與宮腔粘連形成中的膠原沉積及組織重構(gòu)，或許可作為治療宮腔粘連的靶標(biāo)。

表3 下調(diào)差異基因參與的顯著性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Tab.3 Signal pathway of down-regulated gene participating

圖1 宮腔粘連組織與正常子宮組織中靶基因表達(dá)水平Fig.1 Target gene expression level of IUA and normal uterus tissueA：mRNA gene chip；B：real-time PCR;IUA：intrauterine adhesion；PCR：polymerase chain reaction.

來(lái)自美國(guó)紐約州立大學(xué)的Alimperti等[8]對(duì)鈣黏素2亞型(cadherin-2，CDH2)調(diào)節(jié)的信號(hào)對(duì)干細(xì)胞分化的影響進(jìn)行了報(bào)道。CDH2是一種鈣離子依賴(lài)跨膜糖蛋白，是粘連蛋白家族中的一員。在保持細(xì)胞與細(xì)胞粘連帶中起重要的作用，是與ECM相關(guān)的重要的跨膜分子[9-10]。CDH2是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的標(biāo)志，其效應(yīng)是產(chǎn)生纖維細(xì)胞，來(lái)修復(fù)由于炎性反應(yīng)或損傷造成的組織傷害。在生理情況下EMT轉(zhuǎn)換是靜止的，但當(dāng)炎性反應(yīng)激活時(shí)，EMT持續(xù)存在，最終導(dǎo)致器官纖維化[11]，兩位學(xué)者[8]深信對(duì)細(xì)胞間粘連信號(hào)如何影響細(xì)胞轉(zhuǎn)換與分化的研究會(huì)幫助研究人員設(shè)計(jì)特定的生物材料與細(xì)胞支架，從而控制干細(xì)胞的分化，給組織再生醫(yī)學(xué)帶來(lái)啟示。在本課題組的研究中，宮腔粘連組織中神經(jīng)元CDH2的表達(dá)上調(diào)1.6倍(P=0.01)。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明可通過(guò)細(xì)胞粘連分子通路影響CDH2的表達(dá)，CDH2是ECM相關(guān)的跨膜分子，推斷在宮腔粘連形成中可能存在通過(guò)CAM通路調(diào)控CDH2從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能的機(jī)制。

德國(guó)的學(xué)者Gr?ssel等[12]對(duì)膠原蛋白16(collagen ⅩⅥ， COL16)與健康和疾病的研究進(jìn)行了報(bào)道。膠原蛋白16是由子宮基質(zhì)細(xì)胞分泌合成的，是微小纖維相關(guān)膠原家族中的一員。它可以連接并組成大纖維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的完整與穩(wěn)定。研究[13-14]表明，在生理情況下腸道肌成纖維細(xì)胞分泌COL16，當(dāng)腸道發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，COL16的分泌量增加，并通過(guò)焦點(diǎn)連接起來(lái)，并會(huì)使肌成纖維細(xì)胞聚集，進(jìn)而促進(jìn)腸道組織發(fā)生纖維化反應(yīng)，在病理狀態(tài)下COL16表達(dá)的升高會(huì)促進(jìn)炎性反應(yīng)持續(xù)存在。所以COL16在結(jié)締組織細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面起重要作用[15-16]。在本課題的研究中，相對(duì)于正常子宮組織，宮腔粘連組織中COL16A1的表達(dá)上調(diào) 1.57倍(P=0.019 3)，KEGG分析提示可以通過(guò)整合素調(diào)節(jié)通路調(diào)節(jié)COL16A1的表達(dá)，推斷在宮腔粘連形成中可能存在通過(guò)調(diào)節(jié)整合素信號(hào)通路調(diào)節(jié)COL16A1的機(jī)制影響宮腔粘連組織中膠原蛋白含量的表達(dá)，從而參與宮腔粘連的發(fā)生與發(fā)展。

人解整合素樣金屬蛋白酶9(metalloproteinase domaincontaining protein, ADAM-9)屬于跨膜、包含解離素、金屬蛋白酶成員，在細(xì)胞-細(xì)胞接觸、細(xì)胞-基質(zhì)作用中起一定的作用[17-19]。Mauch等[20]在研究中觀察了ADAM-9蛋白在創(chuàng)傷愈合中所起的作用發(fā)現(xiàn)，ADAM-9敲除的動(dòng)物跟對(duì)照組相比，創(chuàng)傷愈合速度加快。本課題組的研究表明在宮腔粘連組織中ADAM-9的表達(dá)下調(diào)0.58倍(P=0.026)。代謝通路分析提示ADAM-9是TGF-β信號(hào)通路中的基因。據(jù)此可以推斷宮腔粘連發(fā)生發(fā)展中存在通過(guò)調(diào)控TGF-β通路調(diào)控ADAM9參與ECM的轉(zhuǎn)換與重構(gòu)的機(jī)制，調(diào)節(jié)宮腔粘連的形成。

本研究存在以下局限性：首先樣本量少，研究結(jié)果還需基于大樣本的研究的支持。其次，本研究只是初步的分析，還需進(jìn)行大量系統(tǒng)的研究來(lái)驗(yàn)證這些ECM相關(guān)基因通過(guò)特定的通路調(diào)節(jié)參與宮腔粘連發(fā)生與發(fā)展中的作用機(jī)制。這些結(jié)果只是初步的研究結(jié)果，距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的距離，還需大量系統(tǒng)的研究。利用生物信息學(xué)分析能有效挖掘基因芯片數(shù)據(jù)，而本研究為宮腔粘連發(fā)病分子機(jī)制的研究提供了新的視野。