張玉香 ，王一強 ，姜德民 ，王鳳麗 ，史曉偉 ，陳有源 ，王俊喹 甘肅省中醫(yī)學校，甘肅 蘭州 70050；甘肅省中醫(yī)院；蘭州市安寧區(qū)醫(yī)院；西和縣中醫(yī)院

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFLD)是肝細胞性肝硬化的重要病因［1-2］。近年來，發(fā)病率呈逐年上升趨勢［3-4］。而中醫(yī)藥在治療NAFLD方面起到越來越重要的作用，主要作用機制為調節(jié)脂肪組織分泌和儲存、改善胰島素抵抗、調節(jié)氧化應激等［5］，具有多靶點治療、安全可靠的特點。清肝利濕活血方為王俊喹經驗方，用于治療肝經濕熱瘀阻型NAFLD。前期臨床研究［6］表明，其具有改善NAFLD患者臨床癥狀，降低體質指數、腰圍，改善肝功能和胰島素抵抗，調節(jié)血脂代謝的作用。本研究采用高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察清肝祛濕活血方對NAFLD大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)及肝臟組織病理形態(tài)學的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取同批清潔級SD大鼠，雄性，90只，體質量130～170 g，由甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 實驗藥物 清肝祛濕活血方藥物組成：茵陳10g，郁金 10g，青葙子 10g，丹參 15g，夏枯草 10g，密蒙花10 g，垂盆草10 g。由甘肅中醫(yī)藥大學藥學實驗室制備中藥煎劑。羅格列酮片(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司生產，國藥準字H20041399，規(guī)格4 mg/粒)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物研究所。

1.3 實驗儀器 GS300型血糖儀(華廣生技股份有限公司)；OHAUS1/1000型電子天平(美國BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；LKB-Ⅲ型超薄切片機(瑞典LKB公司)；TC-120型生物組織自動脫水機(孝感泰維電子設備有限公司)；HH-S型數顯水浴箱(金壇醫(yī)療儀器廠)；5417R型低溫離心機(德國艾本德公司)；TC-120型生物組織自動脫水機(湖北泰維電子設備有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與造模 將90只實驗動物隨機分為正常對照組，模型對照組，羅格列酮組，清肝祛濕活血方高、中、低劑量組，每組15只。大鼠適應性飼養(yǎng)7天，常規(guī)飲食，自由飲水。從第8天開始正常組給予普通飼料，連續(xù)60天；其余各組按照聶文山等［7］的造模方法，予高脂飼料(84%基礎飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)喂養(yǎng)1周后腹腔注射四環(huán)素(150 μg/g，然后每隔6天腹腔注射1次四環(huán)素)100 μg/g；分別于實驗開始前及造模后第 6、12、18、24、30 天稱量大鼠的體質量，依據造模大鼠體質量的變化改變給藥量，造模時間30天。

1.4.2 給藥方法 參考《藥物試驗方法學》［8］，按照人與大鼠的體質量換算，大鼠的等效劑量為：生藥11.25 g/kg。中藥復方高、中、低劑量組依次為生藥22.50、11.25、5.63 g/kg。將清肝祛濕活血方用蒸餾水配制成濃度為0.28、0.56、1.13 g/mL的溶液。根據文獻［9］報道，羅格列酮組用藥劑量為3mg/(kg·d)造模成功后大鼠平均體質量按200g/只計算，干預組各大鼠每日灌胃給藥1次，每次4 mL。正常對照組與模型對照組分別給予蒸餾水灌胃，1/d次，4 mL/次。各組大鼠連續(xù)灌胃30天，末次灌胃24小時后處死并測定相關指標。

1.4.3 觀察指標

1.4.3.1 TNF-α測定 實驗前大鼠空腹至少8小時，經鼠尾采血5 mL，室溫放置2小時后，離心15分鐘，3 000 r/min，取上清液，放冰箱-20℃保存。TNF-α采用酶聯免疫吸附法定量檢測。

1.4.3.2 肝臟組織病理形態(tài)觀察 處死大鼠，迅速摘取肝組織，并將肝臟浸泡于10%甲醛內固定，石蠟包埋，切片，進行常規(guī)HE染色。肝組織脂變程度判斷標準。見表1。

表1 肝組織脂變程度判斷標準

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數據均經SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行處理，計量資料用(±s)表示，采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清TNF-α 羅格列酮致大鼠死亡1只，中藥復方低、中、高劑量組分別死亡2只，2只及4只。血清TNF-α水平，與正常對照組相比，模型對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型對照組比較，清肝祛濕活血方各劑量組及羅格列酮組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

注：*表示與空白對照組比較，P＜0.05；#表示與模型對照組比較，P＜0.05

組別 只數 劑量/(g·kg-1) TNF-α/(mol·L-1)空白對照組 15 - 0.88±0.14模型對照組 15 - 2.68±0.20*羅格列酮組 14 0.55 1.69±0.11#低劑量組 13 5.63 2.08±0.16#中劑量組 13 11.25 1.72±0.18#高劑量組 11 22.5 1.35±0.14#

2.2 肝臟組織病理形態(tài) 空白對照組大鼠肝臟外形大小正常，呈紅色，肝小葉內未見脂滴肝細胞，為陰性。模型對照組大鼠腹腔肥大，肝體積增大明顯，脂肪組織豐富，表面粗糙呈灰黃色，肝血竇擴張，充血，切面油膩感，胞質內幾乎均呈脂滴肝細胞，為(++++)。與模型對照相比較，羅格列酮組，中藥復方低、中劑量組大鼠肝臟脂肪組織含量減少，肝臟體積偏大，呈暗紅色。脂變程度較輕，空泡樣變肝細胞數目明顯減少，胞漿內僅見少量脂肪滴，為(++)。中藥復方高劑量組肝臟脂變程度明顯減輕，肝小葉基本完整，空泡樣變肝細胞消失，為(+)。見圖1。

圖1 肝組織病理切片(HE×400)

3 討論

NAFLD的發(fā)病與胰島素抵抗和遺傳易感性關系密切。根據臨床不同時期的臨床表現可將其歸屬于中醫(yī)學中“脂滿”“肝著”“積聚”“痰證”等范疇。本課題組認為NAFLD的病機為肝火旺盛、濕熱瘀結。清肝祛濕活血方以夏枯草清肝散郁；密蒙花清熱瀉火，養(yǎng)肝明目；青葙子清肝涼血；茵陳清熱利濕、退黃；垂盆草清熱解毒、利膽；丹參、郁金散結化瘀，行氣通絡。諸藥合用活血化瘀，清肝祛濕［10-11］。

近來有關炎癥因子TNF-α在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關注［12］。TNF-α是機體炎癥反應和免疫應答反應的主要調節(jié)因子，其可通過增加氧自由基和脂質過氧化而導致脂肪性肝纖維化。黃永紅［13］研究指出，NAFLD發(fā)展到一定階段時，脂肪組織中的TNF-α水平與胰島素抵抗呈正相關。研究發(fā)現，TNF-α是非糖基化細胞因子，是炎癥和代謝失衡的重要脂肪因子，可引起線粒體功能不全、肝細胞變性壞死及炎細胞浸潤，加重脂肪肝的程度［14-15］。本研究結果也進一步證實，清肝祛濕活血方高劑量干預組可顯著降低NAFLD大鼠TNF-α水平，說明清肝祛濕活血方可通過增強機體對TNF-α的清除能力來改善NAFLD。這與相關文獻［16］報道一致。

綜上所述，清肝祛濕活血方防治非酒精性脂肪肝可能的機制是下調肝臟TNF-α水平。