劉樹根，李澤玲，羅新輝，魏桂林*

(1.泉州羅裳制藥廠 藥物研究中心，福建 泉州 362000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥劑科，江西 贛州 341000)

近年來由于生活方式的改變，中國糖尿病患病率高達11.6%，位居全球之首[1]。其中約有30%～40%的2型糖尿病患者隨著病情進展進入臨床腎病階段，其中約20%患者逐漸發(fā)展為間質(zhì)纖維化，最終進展為慢性腎功能衰竭，約50%患者在5年內(nèi)死亡。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并發(fā)癥，是最嚴重的并發(fā)癥之一，由于起病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，但隨病情發(fā)展與病變程度加劇，是導(dǎo)致終末期腎病和患者死亡的主要原因[2- 3]。糖尿病腎病主要表現(xiàn)腎小球肥大，基底膜增厚，逐漸發(fā)展為間質(zhì)纖維化，最終進展為慢性腎功能衰竭。但具體的發(fā)病機制尚未明確，尚未有特效的治療，因此需要對其發(fā)病機制進行深入研究。

氯化兩面針堿(nitidine chloride，NC)是從天然植物兩面針的干燥根中提取的生物堿，既往對氯化兩面針堿的研究主要是在抗腫瘤活性方面[4]。研究發(fā)現(xiàn)，氯化兩面針堿對黑色素瘤細胞、乳腺癌細胞及前列腺細胞的增殖具有抑制作用，但其抗腫瘤活性弱于喜樹堿及其衍生物[5]。到目前為止尚未有文獻提出氯化兩面針堿對糖尿病腎病的治療作用。本研究首次采用氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠進行干預(yù)，從而觀察氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用，并探討其初步的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級SD大鼠，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量180～220 g [鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號：SYXK(豫)2013- 0006]，進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開展實驗。

1.1.2 實驗材料：高糖高脂飼料由動物實驗中心配制，成分：基礎(chǔ)飼料63.5%、豬油8%、蛋黃粉10%、蔗糖18%、膽酸鈉0.5%；鏈脲佐菌素(Sigma-Aldrich公司)；考馬斯亮藍染色試劑盒(江蘇碧云天生物研究所)；Albumin尿白蛋白(大鼠) 放射免疫試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；氯化兩面針堿(nitidine chloride, NC)(淡黃色針狀結(jié)晶，純度>98%，成都普思生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：20150413)；TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3與Smad7的抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對照組(control)和糖尿病腎病組(DN組)。采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后，禁食過夜，次日采用鏈脲佐菌素腹腔單劑量注射，35 mg/kg，注射完畢，繼續(xù)采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，正常飲水。72 h后尾靜脈取血測定空腹血糖值(FBG)，F(xiàn)BG值大于16.7 mmol/L、尿量大于原尿量50%且尿蛋白(UPro)排泄率大于30 mg/24 h為糖尿病腎病模型造模成功；NC- 20和40 mg/kg干預(yù)組，灌胃氯化兩面針堿，1次/d，共7周。

1.2.2 樣本收集：實驗結(jié)束前1 d，收集24 h尿液；收集血清；麻醉大鼠，摘取左右腎臟，備用。

1.2.3 尿液生化指標測定： 用考馬斯亮藍染色試劑盒檢測24 h尿蛋白(UPro)含量；用albumin尿白蛋白(大鼠) 放射免疫試劑盒測定尿白蛋白(UAlb)含量。

1.2.4 血清生化指標測定：用7150全自動生化分析儀檢測血尿素氮(BUN)和血肌酐(SCr)含量。

1.2.5 過碘酸希夫(PAS)染色法：將腎臟組織制作成石蠟固定切片，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗滌2 min，過碘酸氧化液浸洗約10～20 min，蒸餾水洗滌2 min，置于Schiff液中染色20 min，蒸餾水沖洗5 min，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干，置于顯微鏡下觀察。

1.2.6 血清中胰島素與胰高血糖素含量水平的檢測：用試劑盒檢測各組大鼠血清中的胰島素與胰高血糖素。胰島素結(jié)果以胰島素μIU/mL血清，胰高血糖素以胰高血糖素pg/mL血清表示。

1.2.7 原位末端標記法檢測腎小球細胞凋亡：將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，5%過碘酸室溫孵育1～2 min，PBS漂洗3次，加入20 μg/mL蛋白酶K工作液，37 ℃反應(yīng)20 min，4%多聚甲醛固定5 min，加入100 μL平衡液10 min，滴加Tunel反應(yīng)液，并于濕盒中避光反應(yīng)30 min， PBS漂洗3次，滴入DAPI染液，孵育15 min，封片。將切片置于顯微鏡下觀察，細胞核中有棕黃色顆粒為凋亡細胞。

1.2.8 免疫印跡法檢測：將100 mg腎臟組織樣本冰上剪碎，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，冰上勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液進行蛋白定量，進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入封閉液中室溫孵育1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌2次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，化學(xué)發(fā)光法顯色，將將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠尿液生化指標和血清生化指標的影響

與對照組相比，糖尿病腎病組大鼠24 h尿蛋白(UPro)、尿白蛋白(UAlb)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量均升高(P<0.05)；與糖尿病腎病組大鼠相比，給予氯化兩面針堿干預(yù)后，大鼠24 h尿蛋白(UPro)、尿白蛋白(UAlb)、血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)含量均降低(P<0.05)，與藥物劑量相關(guān)(圖1)。

2.2 氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠胰島素和胰高血糖素含量的影響

與對照組相比，糖尿病腎病組大鼠血清中胰島素的含量降低(P<0.05)，胰高血糖素的含量升高(P<0.05)；與糖尿病腎病組大鼠相比，給予氯化兩面針堿干預(yù)后，大鼠血清中的胰島素含量升高(P<0.05)，胰高血糖素含量降低(P<0.05)，與藥物劑量相關(guān)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group圖2 氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠胰島素和胰高血糖素含量的影響

2.3 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化

對照組大鼠的腎臟組織未出現(xiàn)明顯病理變化；糖尿病腎病組大鼠的腎小葉中央可見PAS染色陽性物質(zhì)，基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小球呈現(xiàn)彌漫性病變；給予氯化兩面針堿干預(yù)后，腎臟的PAS染色呈弱陽性，可見彌漫性腎小球硬化，高劑量組無基底膜增厚及腎小管病變(圖3)。

圖3 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化Fig 3 Pathological changes of kidney in each group(×200)

2.4 各組大鼠腎小球細胞凋亡的變化

對照組大鼠腎小球細胞未出現(xiàn)凋亡；糖尿病腎病組大鼠腎小球細胞凋亡明顯；與糖尿病腎病組相比，給氯化兩面針堿干預(yù)后，大鼠腎小球細胞凋亡數(shù)明顯減少，并隨藥物劑量增大而細胞凋亡數(shù)逐漸減少(圖4)。

2.5 各組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7蛋白表達的變化

與對照組相比，糖尿病腎病組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7的蛋白表達增加(P<0.05)；與糖尿病腎病組相比，給氯化兩面針堿干預(yù)后，NC- 20 mg/kg和40 mg/kg組大鼠腎組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3與Smad7的蛋白表達下降(P<0.05)，Smad2與Smad3蛋白表達無顯著變化(圖5，6)。

3 討論

DN發(fā)病機制主要涉及腎組織反復(fù)損傷、修復(fù)和纖維化。DN腎組織在長期高糖刺激下，TGF-β/Smad信號通路被激活，進而進一步促進DN腎組織的纖維化進展[6]。而轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)在DN纖維化TGF-β/Smad信號中處于中心地位[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TGF-β1的蛋白表達升高，給予氯化兩面針堿干預(yù)后，TGF-β1的蛋白表達降低。活化的TGF-βRI磷酸化后，激活Smad2和Smad3蛋白被磷酸化，然后與Smad4結(jié)合形成異三聚體并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，介導(dǎo)上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換、腎細胞凋亡等，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化[8]。而Smad7是TGF-β/Smad通路中的一個負反饋抑制劑，能夠干擾Smad2與Smad3的磷酸化而抑制其傳導(dǎo)[9]。研究發(fā)現(xiàn)當TGF-β/Smad信號通路處于高度激活狀態(tài)，腎臟系膜細胞、腎小管上皮細胞和血管平滑肌細胞中的膠原合成顯著增加，形成腎間質(zhì)纖維化，并出現(xiàn)Smad7功能的缺失[10]。實驗結(jié)果顯示，在采用氯化兩面針堿干預(yù)后，TGF-β的蛋白表達下調(diào)，Smad2與Smad3磷酸化水平明顯低于未干預(yù)前，此外，Smad7的蛋白表達下調(diào)，推測是氯化兩面針堿可能是通過抑制TGF-β/Smad信號通路，從而降低腎臟組織膠原合成，降低腎間質(zhì)纖維化，起到保護腎臟的作用。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group圖4 氯化兩面針堿對各組大鼠腎小球細胞凋亡的影響Fig 4 The effect of nitidine chloride on the apoptosis of glomerular cells in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group圖5 各組大鼠腎組織中p-Smad2與p-Smad3蛋白表達的變化Fig 5 The change of protein expression of p-Smad2 and p-Smad3 in kidney

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with DN group圖6 各組大鼠腎組織中TGF-β1與Smad7蛋白表達的變化Fig 6 The change of protein expression of TGF-β1 and Smad7 in kidney

綜上所述，本實驗通過氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠的基礎(chǔ)研究，發(fā)現(xiàn)氯化兩面針堿對糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護作用，其可能的作用機制可能是通過抑制TGF-β/Smad信號通路。