蔣淑君，王 娜，王德華，于延銘

(濱州醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院； 2.臨床學(xué)院， 山東 煙臺(tái) 264003)

線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(mitochondrial-associated endoplasmic reticulum membranes, MAM)是指線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間形成的緊密物理連接[1]。MAM與鈣信號(hào)調(diào)控、脂質(zhì)合成與運(yùn)輸、線粒體形態(tài)功能調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等都有密切聯(lián)系[2-4]。MAM募集多種與Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白分子， 形成高濃度的Ca2+微區(qū)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體間Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)。MAM區(qū)域富含定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的鈣釋放通道蛋白IP3R(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor)和定位于線粒體外膜的孔蛋白VDAC1(voltage-dependent anion-selective channel protein 1)，兩者經(jīng)分子伴侶GRP75(glucose-regulated protein 75)連接形成IP3R-GRP75-VDAC1復(fù)合物， Sigma-1R、FUNDC1、mTOR2和PERK等多種蛋白參與調(diào)控，構(gòu)成促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間鈣信號(hào)傳導(dǎo)通路。興奮時(shí)，Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被釋放到胞質(zhì)中作為鈣信號(hào)，線粒體攝取并儲(chǔ)存少量Ca2+。Ca2+可以調(diào)節(jié)線粒體功能，從而影響細(xì)胞功能狀態(tài)；而線粒體對(duì)Ca2+攝取也會(huì)改變Ca2+信號(hào)[5-6]。MAM不僅提供Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的平臺(tái)，而且將線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)兩個(gè)細(xì)胞器功能偶聯(lián)起來，在細(xì)胞代謝、生物能學(xué)和細(xì)胞死亡等多層面上影響細(xì)胞生命活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)研究不同年齡小鼠海馬MAM中鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白IP3R、GRP75、VDAC1和Sig-1R的表達(dá)，探討神經(jīng)細(xì)胞衰老過程中參與 MAM鈣信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白，為衰老、神經(jīng)退行性疾病等研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)C57/BL6J小鼠，雄性，2～24月齡，體質(zhì)量18～32 g(濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物部，合格證號(hào)：SCXK-2016-0011)。組織RNA提取試劑盒(Qiagen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script公司)，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒(Biosystems公司)。Sig-1R抗體、GRP75抗體、IP3R抗體、VDAC1抗體 和β-actin抗體(Abcam公司)。羊抗兔或羊抗鼠熒光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及海馬組織取材：小鼠按月齡分為：2(2 Mo)、6(6 Mo)、12(12 Mo)、18(18 Mo)和24月齡(24 Mo)，每組6只。 斷頭取小鼠雙側(cè)海馬迅速凍存于液氮，在-80 ℃低溫冰箱保存用于mRNA和蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2 海馬組織總RNA提取和 real-time PCR 檢測(cè)mRNA：用試劑盒提取海馬組織中總RNA，將RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用針對(duì)VDAC1、GRP75、IP3R和Sig-1R的特異性引物按照實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒說明方法檢測(cè)其基因的變化，β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，引物序列如表1。

表1 RT-PCR 的引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.3 Western blot 檢測(cè)海馬組織VDAC1、IP3R、 GRP75和Sig-1R 蛋白表達(dá)：用裂解液進(jìn)行海馬組織勻漿, 提取全細(xì)胞蛋白、BCA法定量。蛋白樣品進(jìn)行電泳(12% SDS-PAGE), 轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用1%脫脂奶粉封閉，然后與VADC1(1∶1 000)、IP3R(1∶1 000)、GRP75(1∶1 000)、Sig-1R(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體孵育過夜，經(jīng)TBST洗滌后再與羊抗兔(goat anti-rabbit IR Dye 680LT) 或羊抗鼠(goat anti-mouse IR Dye 800CW)熒光二抗孵育45 min，最后經(jīng)過TBST洗滌后，用Odyssey雙紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像和定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同年齡小鼠海馬VDAC1、GRP75、IP3R 和Sig-1R mRNA的表達(dá)

在不同月齡組VDAC1 mRNA變化不明顯。IP3R mRNA隨年齡增長(zhǎng)有降低趨勢(shì)，24 Mo組與2 Mo組相比顯著性降低(P<0.05)。隨年齡增長(zhǎng)GRP75基因表達(dá)明顯增加，2 Mo、6 Mo組與12 Mo、18 Mo和24 Mo兩兩組間比較均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。Sig-1R mRNA隨年齡增長(zhǎng)表達(dá)減少，24 Mo組與2 Mo、6 Mo組比較有顯著性降低(P<0.01,P<0.05)(圖1)。

2.2 不同年齡小鼠海馬VDAC1、GRP75、IP3R、Sig-1R 蛋白表達(dá)

隨年齡增長(zhǎng)小鼠海馬組織中VDAC1和IP3R的表達(dá)量在各月齡小鼠間變化不明顯。老年小鼠(18 Mo、24 Mo組)比 年輕小鼠(2 Mo、6 Mo組)GRP75表達(dá)量明顯增多， 18 Mo、24 Mo組與2 Mo、6 Mo組兩兩組間比較均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。Sig-1R隨年齡增長(zhǎng)蛋白表達(dá)量減少，24 Mo組與2 Mo組比較顯著性降低(P<0.05)(圖2)。

3 討論

線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的鈣穩(wěn)態(tài)失衡在衰老、神經(jīng)退行性疾病中起著重要作用，通過調(diào)控MAM線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過程可以影響神經(jīng)元的狀態(tài)[7]。在長(zhǎng)期培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)鈣調(diào)節(jié)能力降低，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)增加，線粒體攝鈣增多破壞棘突穩(wěn)定性，導(dǎo)致年齡相關(guān)的認(rèn)知功能降低[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體間Ca2+的交聯(lián)是通過MAM募集 IP3R、GRP75、VDAC1、Sig-1R-BIP等數(shù)十種蛋白形成高鈣微區(qū)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子在較短的擴(kuò)散范圍內(nèi)保持較高濃度，從而被線粒體攝取。用外源分子使MAM緊密連接膜間距更近，線粒體內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，線粒體鈣超載，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而用蛋白酶水解使MAM物理連接解離，MAM膜間距增大，線粒體則不能攝取鈣離子[9]。

衰老、神經(jīng)退行性疾病等病理生理過程中MAM某些重要蛋白缺失或膜間距的變化對(duì)于鈣信號(hào)傳導(dǎo)和線粒體功能具有重要影響[10]。IP3R-GRP75-VDAC1復(fù)合物是實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放和線粒體Ca2+攝取的重要結(jié)構(gòu)，其中分子伴侶GRP75起著重要的連接作用。有研究認(rèn)為在神經(jīng)細(xì)胞中GRP75的主要作用是調(diào)節(jié)線粒體功能、Ca2+和氧化還原穩(wěn)態(tài)，但在不同細(xì)胞不同狀態(tài)下作用不同。在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)GRP75降低生理狀態(tài)ROS水平，GRP75在這些細(xì)胞中敲除則激活了線粒體應(yīng)激反應(yīng)[11]。在谷氨酸導(dǎo)致的氧化應(yīng)激模型中敲除或沉默GRP75基因，減低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接，可緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的胞質(zhì)和線粒體鈣超載，阻斷ROS生成，保護(hù)線粒體呼吸鏈，過表達(dá)GRP75則加強(qiáng)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡[12]。Sig-1R在各類神經(jīng)細(xì)胞中分布廣泛，有神經(jīng)細(xì)胞再生、神經(jīng)保護(hù)等多方面功能。 在生理和病理狀態(tài)下都具有分子伴侶和感受Ca2+濃度的作用，在MAM Sig-1R通過和IP3R連接調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣信號(hào)和線粒體鈣穩(wěn)態(tài)[13]。

*P<0.05, **P<0.01 compared with 2 Mo group; #P<0.05 compared with 6 Mo group圖2 不同月齡小鼠海馬中VDAC1、GRP75、IP3R、Sig-1R蛋白表達(dá)

海馬的全基因組表達(dá)譜被廣泛用于研究人類死后腦組織中阿爾茨海默病(AD)的衰老和發(fā)病機(jī)制[14]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)老年小鼠海馬MAM鈣信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白進(jìn)行了基因水平和蛋白水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬組織中GRP75 mRNA和蛋白表達(dá)在增齡過程中明顯升高， Sig-1R在增齡過程中 mRNA和蛋白表達(dá)降低。提示MAM鈣信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞內(nèi)鈣超載和隨后的細(xì)胞衰老死亡的一個(gè)重要途徑，GRP75、Sig-1R可作為靶向神經(jīng)細(xì)胞衰老時(shí)MAM鈣信號(hào)傳導(dǎo)過程的關(guān)鍵分子，為進(jìn)一步開展衰老及抗衰老生理及抗衰老藥物研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。