嚴(yán)玉蘭，邵小美，劉 沙，杭 敏，尹超云，張日婷，步雪峰

(江蘇大學(xué) 1.附屬人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002； 2.醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3.附屬人民醫(yī)院 普外科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，在中國，隨著工業(yè)化速度加快，環(huán)境污染加重，人口老齡化加劇和肺癌的腫瘤負(fù)擔(dān)日益加重[1- 2]。嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。4-苯基丁酸 (4-phenyl butyric acid，4-PBA) 能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)向胞質(zhì)方向的運(yùn)輸，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，常作為一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑使用。重組新城疫病毒rL-IL29抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移，并且促進(jìn)其凋亡[4]。但是rL-IL29對(duì)于肺癌細(xì)胞引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡之間關(guān)系沒有相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)采用rL-IL29感染H446肺癌細(xì)胞檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡相關(guān)蛋白，并使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，旨在探討rL-IL29對(duì)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)(哈爾濱獸醫(yī)研究所)；rL-IL29(本實(shí)驗(yàn)組成功構(gòu)建)；人肺小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心)；4-苯基酸鈉鹽 (sodium 4-phenylbutyrate, 4-PBA)、核熒光染料(Hoechst33342)、Triton X- 100(Sigma-Aldrich 公司)；鼠抗人GRP78、CHOP和β-Tubulin (Santa Cruz公司)；兔抗人半胱氨酸蛋白酶- 3(caspase- 3)、LC3 Ⅰ/Ⅱ (ImmunoWay公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG (上海康為世紀(jì)公司)；Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗鼠IgG、Cy3標(biāo)記羊抗鼠 IgG (KPL公司)；CCK- 8試劑盒(南京厚載生物科技公司)；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染：用無血清1640培養(yǎng)基分別稀釋NDV及rL-IL29原液，H446細(xì)胞用含10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)，24 h更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中匯合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。H446細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～70%時(shí)，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、NDV組及rL-IL29組，后2組分別加入稀釋的NDV、rL-IL29 病毒液體2 mL，培養(yǎng)1 h，更換含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞活力：在96孔板中配制100 μL的細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h (37 ℃、5% CO2)。向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的病毒，NDV及rL-IL29分別稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h后向每孔加入10 μL CCK- 8 溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值。細(xì)胞活力計(jì)算：(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)×100%。

1.2.3 病毒滴度測(cè)定：將細(xì)胞生長狀態(tài)良好的H446細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1×105/mL，加入96孔板，100 μL/孔(37 ℃， 5% CO2)，培養(yǎng)24 h后加病毒。在1.5 mL離心管中，設(shè)置6個(gè)稀釋度，第一管加90 μL培養(yǎng)液，然后加入10 μL病毒原液，混勻后吸取10 μL加入第2個(gè)離心管中，以此類推，培養(yǎng)24 h后觀察其死亡(或陽性)數(shù)，然后計(jì)算出各稀釋點(diǎn)引起死亡累積數(shù)的死亡率。所求得的值就寫為EID50。其算法為：

lgEID50=高于50%死亡的稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)+稀釋系數(shù)的對(duì)數(shù)×距離比

距離比=(高于50%的死亡率-50%)/(高于50%的死亡率-低于50%的死亡率)

1.2.4 4-PBA 預(yù)處理細(xì)胞及分組：將H446細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、4-PBA組、NDV組、NDV+4-PBA組、rL-IL29組和rL-IL29+4-PBA組，當(dāng)細(xì)胞增殖至50%～70%匯合度時(shí)，4-PBA處理組加入10 mmol/L 4-PBA預(yù)處理4 h；棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍；然后加入NDV及rL-IL29病毒分別轉(zhuǎn)染24 h，無病毒組加入PBS替代。

1.2.5 免疫熒光染色觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)：取“1.2.1”中3組細(xì)胞，分別用4%低聚甲醛室溫固定20 min，PBS(pH=7.4)洗3次，含0.5% Triton X- 100的PBS處理30 min，5% BSA封閉1 h，加入含1% BSA的PBS配制的GRP78抗體、CHOP抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜。洗3次，5 min/次；Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗或Cy3標(biāo)記的二抗(1∶500)染色樣本1 h，PBS洗3次，5 min /次；核熒光染料Hoechst33342染色細(xì)胞核5 min，PBS洗3次后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)：將H446細(xì)胞接種至6孔板，棄培養(yǎng)基，PBS(pH =7.4) 洗3遍，加入適量RIPA細(xì)胞裂解液(含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑)于冰上裂解30 min，12 000×g離心5 min，取上清液，100 ℃煮沸5 min。測(cè)濃度后取60 μg蛋白進(jìn)行SDS PAGE，轉(zhuǎn)膜，TBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入IL- 29多克隆抗體(1∶400)、GRP78多克隆抗體(1∶1 000)、CHOP多克隆抗體(1∶400)、cleaved-caspase- 3多克隆抗體(1∶300)、LC3 Ⅰ/Ⅱ抗體(1∶400)、β-Tubulin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，加羊抗鼠或羊抗兔 HRP-IgG(1∶3 000)室溫孵育2 h；TBST洗膜；ECL增強(qiáng)型試劑盒(Amersham Bioseiences公司)發(fā)光顯色，Typhon9400掃描儀記錄結(jié)果，用北京賽制公司的LANE．1D軟件進(jìn)行條帶吸光度值定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞活力

隨著病毒稀釋倍數(shù)的增加，細(xì)胞活性增加，其中rL-IL29組在10-5、10-6細(xì)胞活力>80%, (稀釋10-5時(shí)，t=18.28，稀釋10-6時(shí)，t=10.96，P<0.05)，NDV組在10-6處細(xì)胞活力>80%，(t=26.5，P<0.05)。此時(shí)La Sota系NDV病毒液及rL-IL29病毒液的滴度都在雞胚半數(shù)感染量(50% egg infective doses，EID50) 為109.8 EID 50/mL左右[4]。選用細(xì)胞活力>80%時(shí)的滴度[6]，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)NDV選擇10-6，rL-IL29選擇10-5作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作濃度(圖1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 不同濃度rL-IL29、NDV對(duì)細(xì)胞活力影響Fig 1 Cell growth of lung cancer cells H446 was influenced after infected by different solubilities of rL-IL29

2.2 rL-IL29及NDV感染H446細(xì)胞后檢測(cè)IL- 29蛋白

rL-IL29組IL- 29蛋白表達(dá)較對(duì)照組及NDV組升高(P<0.05)(圖2)。

2.3 rL-IL29感染H446細(xì)胞IL- 29因子的表達(dá)

NDV組及rL-IL29組中均表達(dá)IL- 29因子，在不同濃度中，rL-IL29組中IL- 29表達(dá)量均較NDV組明顯升高(P<0.01)，且rL-IL29組中稀釋100倍較稀釋200倍升高明顯(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group圖2 rL-IL29感染H446細(xì)胞后，Western blot 檢測(cè)IL- 29蛋白表達(dá)Fig 2 Western blot tested the protein of IL- 29 in H446 cells after infected by rL-IL29 or

2.4 rL-IL29作用后檢測(cè)H446細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

免疫熒光檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，圖中紅色熒光為GRP78，綠色熒光為CHOP，NDV及rL-IL29組GRP78熒光皆明顯強(qiáng)于對(duì)照組(圖4)。

2.5 rL-IL29感染及4-PBA處理后，H446細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

rL-IL29組和NDV組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01,P<0.05)，且rL-IL29組GRP78和CHOP表達(dá)明顯高于NDV組(P<0.05)。4-PBA處理后，處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78及CHOP較未處理組降低(P<0.05)(圖5A)。

*P<0.01 compared with control group圖3 rL-IL29感染H446細(xì)胞后，ELISA檢測(cè)上清中 IL- 29因子的含量Fig 3 The content of IL- 29 was detected by ELISA assay in H446 cells after infected by rL-IL29

2.6 rL-IL29感染及4-PBA處理后細(xì)胞內(nèi)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

rL-IL29組自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅰ/Ⅱ及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase- 3表達(dá)較對(duì)照組升高(P<0.05)。在4-PBA處理后，4-PBA處理組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase- 3表達(dá)較未處理組均降低(P<0.05)(圖5B)。

圖4 rL-IL29及NDV感染H446細(xì)胞后，免疫熒光檢測(cè)CHOP及GRP78蛋白的表達(dá)，紅色熒光為GRP78蛋白， 綠色熒光為CHOP蛋白

A.Western blot tested the protein of GRP78,CHOP after injected by rL-IL29 or NDV; B.Western blot tested the protein of LC3 Ⅰ/Ⅱ and cleaved-caspase3 after rL-IL29 or NDV;*P<0.05，**P<0.01 compared with control group

圖5rL-IL29及NDV感染H446細(xì)胞后，Westernblot檢測(cè)GRP78、CHOP、LC3Ⅰ/Ⅱ及cleaved-caspase-3的表達(dá)

3 討論

新城疫病毒(NDV)有很好的溶瘤作用且對(duì)人沒有致病性[7]。NDV刺激可以促進(jìn)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并且能夠通過誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生上調(diào)NK細(xì)胞TRAIL蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)NK細(xì)胞的體外抗腫瘤活性[3]。NDV感染早期可以抑制自噬，加強(qiáng)細(xì)胞凋亡[8]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與炎性反應(yīng)性疾病、代謝性疾病、腫瘤、骨質(zhì)疏松癥及神經(jīng)退行性疾病等有關(guān)[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡及自噬的發(fā)生，抑制自噬可以促進(jìn)凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)通過NDV及rL-IL29感染細(xì)胞后，檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GRP78明顯升高，說明rL-IL29能夠誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

CHOP可通過多種調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在ERS過程中是一個(gè)重要的中間信號(hào)分子。敲除CHOP能夠削弱對(duì)凋亡蛋白的誘導(dǎo)，減少神經(jīng)元死亡[11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白(GRP78/BIP)在正常情況下與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的聚合，使其處于非活化狀態(tài)。但是當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，GRP78 從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白上釋放出來，跨膜蛋白發(fā)生聚合，最終觸發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)[12]。

4-PBA目前可用于研究腫瘤、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等與ERS相關(guān)的疾病[13]。4-PBA能夠顯著緩解七氟醚引起的神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，明顯減少其誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[14]。同時(shí)，4-PBA能通過減輕ERS及降低ERS相關(guān)的促凋亡蛋白CHOP表達(dá)減少心肌細(xì)胞凋亡[15]。 本實(shí)驗(yàn)用4-PBA預(yù)處理H446細(xì)胞，rL-IL29組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達(dá)較未處理組表達(dá)明顯下降，且4-PBA處理后rL-IL29組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase- 3的表達(dá)也明顯下降。說明4-PBA可抑制rL-IL29引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rL-IL29能引起細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑處理后，細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白水平下降。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè)rL-IL29可以促進(jìn)小細(xì)胞肺癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬及凋亡之間相互調(diào)節(jié)關(guān)系及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。