彭 偉，張小歡，劉玲伶，王圓圓，劉麗榮，石明雋，郭 兵

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室； 2.貴州省高校重大疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床血液學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

中國(guó)是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國(guó)家[1]，糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)作為糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥嚴(yán)重影響到國(guó)民的身體健康。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-beta1,TGFβ1)是糖尿病腎臟病變的關(guān)鍵致病因子,TGFβ1/Smads信號(hào)通路是腎纖維化的重要信號(hào)通路之一[2]。SnoN作為一種核轉(zhuǎn)錄共抑制因子，它能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中阻斷TGFβ1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，是該信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子[3]。骨形蛋白- 7(bone morphogenetic protein 7,BMP- 7)已證實(shí)可以通過(guò)激活多種信號(hào)通路來(lái)抗腎臟纖維化病變[4]。有研究表明阿托伐他汀對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用[5],但其具體藥物機(jī)制目前并不清楚。本研究旨在研究阿托伐他汀是否通過(guò)影響B(tài)MP- 7和SnoN的蛋白表達(dá)來(lái)減輕或逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化病變，從而為阿托伐他汀治療DN提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)、ColⅠ和Col Ⅳ抗體(Sigma公司)；SnoN、E-cadherin、Col Ⅲ、BMP- 7及Desmin抗體(Santa Cruze公司)；β-actin抗體(PMK公司)；阿托伐他汀AT(輝瑞制藥有限公司)。

1.1.2 動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量170～200 g[北京華阜生物科技股份有限公司，SCXK(京)2009- 0004]。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對(duì)照組、DM組和AT治療組，大鼠飼養(yǎng)4周后，給予阿托伐他汀10 mg/(kg·d)(0.3%羧甲基纖維素作溶媒)灌胃治療8周。16周后處死大鼠，并進(jìn)行血、尿及腎組織的采集、生化檢測(cè)和腎組織形態(tài)學(xué)的觀察。

1.2.2 免疫組化檢測(cè)：免疫組化SP法檢測(cè)Col Ⅰ(1∶200)、Col Ⅲ(1∶100)在大鼠腎組織的分布和表達(dá)，用PBS作陰性對(duì)照，DAB法顯色，蘇木精復(fù)染。用Olypums-DP72顯微鏡觀察并采集圖片，用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描并分析各圖累計(jì)吸光度值。

1.2.3 Western blot檢測(cè)：取腎組織皮質(zhì)部分，加入組織蛋白提取液后勻漿、離心、取上清，用BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)濃度，取一定量上清液加入加樣緩沖液煮沸15 min。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅳ和β-actin一抗工作液濃度分別為1∶200、1∶200、1∶300、1∶200、1∶1 000、1∶4 000,4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜5 min×3次，特異性二抗室溫孵育1 h后洗膜，ECL顯影、曝光。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image Lab軟件分析各條帶的面積和吸光度值，兩者乘積為積分吸光度值，每個(gè)樣本重復(fù)分析3次。以同一張膜上BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅵ與相應(yīng)的β-actin條帶所測(cè)積分吸光度值的比值，即相對(duì)積分吸光度值對(duì)BMP- 7、SnoN、E-cadherin、Desmin、Col Ⅵ蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)

與對(duì)照組相比，DM組大鼠血糖、三酰甘油、腎臟指數(shù)、尿微量白蛋白/尿肌酐(MA/CR)增多(P<0.05)。AT組大鼠血糖、三酰甘油、腎臟指數(shù)、尿微量白蛋白/肌酐較DM組大鼠顯著回降(P<0.05)(表1)。

2.2 腎小管間質(zhì)形態(tài)學(xué)變化

HE染色可見(jiàn)NC組腎臟結(jié)構(gòu)完整，腎小球結(jié)構(gòu)清晰。DM組大鼠部分腎小管發(fā)生擴(kuò)張，部分腎小管上皮細(xì)胞可以見(jiàn)到有空泡樣變性，細(xì)胞發(fā)生萎縮和脫落，腎小管間質(zhì)細(xì)胞增多伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而AT組病變明顯減輕。腎組織Masson染色顯示NC組腎臟結(jié)構(gòu)完整，清晰，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)飽滿，而DM組腎臟結(jié)構(gòu)排列不清，可見(jiàn)腎小球和腎小管的纖維化病變明顯，AT組病變明顯改善(圖1)。

2.3 免疫組化結(jié)果

與對(duì)照組比較，DM組腎組織Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)增多，而AT組Col Ⅰ、Col Ⅲ表達(dá)相對(duì)減少(圖2)。

2.4 Western blot結(jié)果

與對(duì)照組相比，DM組大鼠E-cadherin、BMP- 7和SnoN表達(dá)減少(P<0.05)減少，Desmin、Col Ⅳ增多(P<0.05)；AT組 E-cadherin、BMP- 7和SnoN的表達(dá)回升，Desmin、Col Ⅳ回降(P<0.05)(圖4)。

表1 各組大鼠血糖、三酰甘油、腎臟指數(shù)、尿微量白蛋白/尿肌酐(MA/CR)水平

*P<0.05 compared with NC group；#P<0.05 compared with DM group.

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Histological change of kidneys in each group rats(×400)

3 討論

DN是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，也是終末期腎臟衰竭的重要病因之一。TGFβ1是糖尿病腎臟病變的關(guān)鍵致病因子，在DN的發(fā)生發(fā)展中，TGFβ1主要介導(dǎo)了腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)換，細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)的沉積引起腎小球的硬化以及腎間質(zhì)的纖維化[2]。阿托伐他汀是一種降脂藥，當(dāng)用于治療DN時(shí)，除了能夠改善糖尿病引起的代謝障礙外[6]，還具有抗纖維化的作用[5]。有少量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，給予糖尿病大鼠阿托伐他汀治療時(shí)，腎臟纖維化病變明顯改善[5- 6]，但是其具體機(jī)制尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下SD大鼠腎組織發(fā)生了明顯纖維化病變，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Desmin表達(dá)增加， 細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Col Ⅳ表達(dá)增加；給予阿托伐他汀治療后腎臟纖維化的病變得到明顯改善。進(jìn)一步證實(shí)了阿托伐他汀具有抗腎臟纖維化的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)BMP- 7和SnoN的表達(dá)抑制TGFβ1/Smads信號(hào)通路。

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with DM group

*P<0.05 compared with NC group; #P<0.05 compared with DM group圖4 E-cadherin、desmin、Col Ⅳ、BMP- 7和SnoN在各組腎組織中的表達(dá)Fig 4 Expressions of E-cadherin, desmin, Col Ⅳ, BMP- 7 and SnoN in kidney tissue in each

BMP- 7是一種35 ku的同型二聚體分泌型糖蛋白，屬于TGF-超家族[7]。它能抑制TGF-β1信號(hào)通路引起的上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換過(guò)程[8]，還能夠通過(guò)拮抗TGF-β1引起的基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的下調(diào)，并且增加阻斷該蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑PAI- 1的轉(zhuǎn)錄和分泌，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制ECM沉積的作用[9]。

SnoN是一種核轉(zhuǎn)錄共抑制因子，它能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中阻斷TGFβ1下游Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，是一種重要的負(fù)調(diào)控因子[10]。在細(xì)胞質(zhì)中，SnoN與Smads蛋白復(fù)合體結(jié)合，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，阻斷TGFβ1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)。而在細(xì)胞核中，SnoN能夠破壞Smad2/3與Smad4形成的復(fù)合物。還能募集其他核轉(zhuǎn)錄共抑制因子與復(fù)合物結(jié)合，抑制核轉(zhuǎn)錄共激活因子而發(fā)揮作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀治療后BMP- 7的表達(dá)增加，同時(shí)SnoN的表達(dá)也上調(diào)。BMP- 7、SnoN作為腎纖維化病程中的負(fù)調(diào)控因子，可以通過(guò)抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)而抑制腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展。在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中BMP- 7可以上調(diào)SnoN mRNA的表達(dá)[11]。因此推測(cè)，阿托伐他汀能夠通過(guò)促進(jìn)BMP- 7、SnoN的蛋白表達(dá)，抑制TGFβ1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用。