楊 琳 田 蕾 周 璇 楊 樂 李麗英

(首都醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系， ‘肝臟保護(hù)和再生調(diào)節(jié)’北京市重點實驗室，北京 100069)

中性粒細(xì)胞是體內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞，來源于骨髓中的造血干細(xì)胞，在骨髓中分化發(fā)育完畢后進(jìn)入血液，參與炎性反應(yīng)，有利于機(jī)體的免疫防御，但其參與的炎性反應(yīng)也會對機(jī)體組織產(chǎn)生損傷[1-3]。中性粒細(xì)胞是循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的白細(xì)胞，它不僅是機(jī)體防御外源病原體入侵的第一道防線，也是參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞[4]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染或者炎性反應(yīng)時，中性粒細(xì)胞能夠迅速遷移至炎性反應(yīng)局部組織殺菌，完成了使命的中性粒細(xì)胞啟動自發(fā)凋亡，保證一些具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)不會被隨意地釋放到組織中，引起不必要的組織損傷，最終凋亡的細(xì)胞被周圍的巨噬細(xì)胞所吞噬清除[5]。故針對中性粒細(xì)胞的功能研究越來越受關(guān)注。但是，這一相關(guān)研究工作開展的前提是分離純化出有活性的小鼠骨髓中性粒細(xì)胞。

目前文獻(xiàn)[6-8]報道的分離人或動物的中性粒細(xì)胞的方法眾多，常用的有密度梯度離心法、Dextran作用下紅細(xì)胞自然沉降法、免疫磁珠等方法，Dextran作用下紅細(xì)胞自然沉降法的回收率比較低，免疫磁珠分選的中性粒細(xì)胞存在一定的局限性。密度梯度離心法是根據(jù)細(xì)胞本身的比重差別來分離各種細(xì)胞的方法，其中最常用的是Percoll非連續(xù)密度梯度離心法，其原理是利用一種密度介于1.075～1.092 g/mL之間、且近于等滲的溶液做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種細(xì)胞加以分離，但是該方法的試劑配制比較繁瑣，而且分離得到的細(xì)胞形態(tài)與原始形態(tài)有差異[8]。

本課題擬優(yōu)化分離純化、鑒定及活性檢測小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的方法，根據(jù)細(xì)胞的密度不同的特點，加入Histopaque?-1077和Histopaque?-1119(兩種市售的不同密度梯度的等滲溶液)來分離中性粒細(xì)胞，將收集的中性粒細(xì)胞加入抗Ly6G(中性粒細(xì)胞的標(biāo)志蛋白)抗體孵育[9]，用高內(nèi)涵篩選和分析儀檢測，加入佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate， PMA)刺激后用高內(nèi)涵篩選和分析儀鑒定其活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1)動物：ICR小鼠(10只雄性)，SPF級，體質(zhì)量28～30 g，5～6周齡，購于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，實驗動物許可證號： SYXK(京)2015—0012。

2)主要儀器：離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司 5810R)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(150i，美國 Thermo 公司)，高內(nèi)涵篩選和分析儀(Cell Insight,美國 Thermo Fisher 公司)。

3)主要試劑：Histopaque?-1077、Histopaque?-1119 (美國 Sigma 公司)， Ly6G 抗體 (美國 BD 公司)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)抗體(美國 Abcam 公司)，F(xiàn)ITC羊抗兔抗體(美國 Jackson Immunoresearch 公司)，Cy3羊抗兔抗體(美國 Jackson Immunoresearch 公司)，DAPI(瑞士Roche 公司)，人纖連蛋白(美國Calbiochem 公司)，PMA(美國 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞分離純化及活性檢測流程

用Histopaque?-1077、Histopaque?-1119分離小鼠骨髓中性粒細(xì)胞流程圖 (圖1)。

1.2.2 小鼠中性粒細(xì)胞分離方法

脫臼處死ICR小鼠，無菌分離其脛骨和股骨，剝離結(jié)締組織及肌肉，置于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，用直剪剪去骨頭兩端，暴露骨髓腔，用1 mL注射器(針規(guī)格 0.45×16)吸取0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液沖洗骨髓腔，并將沖洗液用 70 μm 的尼龍濾網(wǎng)過濾到50 mL離心管中，1 200 g離心5 min收集細(xì)胞，用 3 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液重懸，將細(xì)胞懸液置于 9 mL Histopaque?-1077 上，4 ℃ 2 000 g無制動離心20 min，棄上清，用 5 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于10 mL Histopaque?-1119 上，4 ℃ 2 000 g無制動離心20 min，收集中間絮狀層即為中性粒細(xì)胞。

1.2.3 小鼠中性粒細(xì)胞鑒定

將收集的細(xì)胞，加入等量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，1 200 g 離心5 min用200 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液重懸細(xì)胞，加入200 μL 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5% PBST[含 0.5%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100 的 PBS]破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA 37 ℃ 30 min，加兔抗 Ly6G(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加山羊抗兔FITC(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，加入到96孔板中用高內(nèi)涵分析儀觀察，拍片。

1.2.4 小鼠中性粒細(xì)胞活性檢測

使用終濃度5 μg/cm2中人纖連蛋白(fibronectin)包被96孔板，將細(xì)胞懸液50 μL(105個)加到包被的板子上，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，將96孔板內(nèi)的細(xì)胞采用數(shù)字表法隨機(jī)分為實驗組和對照組，實驗組：加100 nmol/L PMA，對照組：加入與實驗組中 PMA相同體積的1640 培養(yǎng)基，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，加入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，0.5%(體積分?jǐn)?shù)) PBST破膜 15 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) BSA 37 ℃ 封閉30 min，加兔抗 MPO(1∶200)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加羊抗兔Cy3(1∶100)37 ℃ 孵育1 h，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，加DAPI(1∶100)5 min，用 PBS 洗 3 次，每次 5 min，用高內(nèi)涵分析儀10×物鏡觀察并拍片檢測小鼠中性粒細(xì)胞MPO的表達(dá)情況。采用高內(nèi)涵分析軟件(美國Thermo Fisher公司)分析所獲取的圖像結(jié)果，實驗重復(fù)3次，將3次結(jié)果取平均值進(jìn)行倍數(shù)比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠中性粒細(xì)胞的鑒定

將分離純化的細(xì)胞用免疫熒光的方法染色，采用高內(nèi)涵分析儀檢測觀察中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物 Ly6G的表達(dá)情況。結(jié)果顯示細(xì)胞 100% 表達(dá) Ly6G (圖2)，說明分離純化的細(xì)胞是中性粒細(xì)胞。

圖1 提取小鼠骨髓中性粒細(xì)胞流程圖Fig.1 Scheme of mouse neutrophils from bone marrow

圖2 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)Fig.2 Ly6G were expressed in mouse neutrophils from bone marrow

Representative images of neutrophils Ly6G (green) were showed by immunofluorescence.Ly6G(-)：without Ly6G antibody; Ly6G(+)： with Ly6G antibody. Nuclei were stained with DAPI. High Content Screening(20×).

2.2 小鼠中性粒細(xì)胞活性的鑒定

用100 nmol/L PMA刺激，檢測 MPO 的表達(dá)。結(jié)果顯示加入PMA刺激后，中性粒細(xì)胞MPO表達(dá)增強(qiáng)，實驗重復(fù)3次，單次檢測結(jié)果詳見圖3A，用高內(nèi)涵分析軟件(Thermo Scientific Cellomics iDEV Software)分析所獲取的圖像，將3次的熒光強(qiáng)度取平均值進(jìn)行倍數(shù)比較。實驗組的熒光強(qiáng)度是9 052±1 039.16，對照組的熒光強(qiáng)度29 547.67±1 997.33，實驗組是對照組的(3.26±0.22)倍(P<0.05)，詳見圖3B。

圖3 小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的活性鑒定Fig.3 MPO was expressed in mouse neutrophils from bone marrow

3 討論

中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是最先募集到感染部位的免疫細(xì)胞，在固有免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。中性粒細(xì)胞是宿主防御過程中的重要環(huán)節(jié)之一，它在組織器官中發(fā)揮著抵抗病原菌的作用，如在動脈粥樣硬化、血管炎、血栓形成、肝損傷等多種疾病中均發(fā)揮著重要作用[10-15]。中性粒細(xì)胞和它引發(fā)的炎性反應(yīng)在組織損傷過程中也有重要作用，所以中性粒細(xì)胞的研究也越來越受關(guān)注。本實驗室近期研究關(guān)注中性粒細(xì)胞在小鼠纖維化模型中的作用，建立一種簡單的分離純化和活性鑒定中性粒細(xì)胞的方法是進(jìn)行研究的第一步。Histopaque?-1077是淋巴細(xì)胞分離液，Histopaque?-1119是單個核細(xì)胞和粒細(xì)胞分離液，本實驗是利用細(xì)胞本身的比重差別將二者一起使用來分離中性粒細(xì)胞。MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，又稱髓過氧化物酶，外界刺激可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集釋放MPO[16]，這是中性粒細(xì)胞發(fā)揮功能的主要方式之一，因此用 PMA 刺激提取的小鼠骨髓中性粒細(xì)胞，檢測 MPO 的表達(dá)來鑒定小鼠中性粒細(xì)胞活性。與傳統(tǒng)方法比較，本實驗室采用的分離純化的小鼠骨髓中性粒細(xì)胞活性以及功能、細(xì)胞純度、分離純化效率并未發(fā)生明顯改變[17]，但是本分離方法簡便易操作，試劑更規(guī)范化，能夠有效地分離并鑒定出有活性的中性粒細(xì)胞，為進(jìn)一步研究中性粒細(xì)胞在肝纖維化中的作用奠定基礎(chǔ)。