宮曉麗 劉夢(mèng)茹 王 樂(lè) 劉 玚 張 婷 孫 英 王曉民2，*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069；3. 首都醫(yī)科大學(xué)教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069；4. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069)

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中唯一的固有免疫細(xì)胞，當(dāng)受到感染、毒物、致病蛋白等因素刺激后會(huì)發(fā)生炎性反應(yīng)激活釋放大量促炎因子。除了炎性作用之外，小膠質(zhì)還有一種重要的功能：吞噬作用。小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)吞噬作用清理細(xì)胞碎片、清除異常蛋白。小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能近年來(lái)被認(rèn)定為是引起細(xì)胞死亡的一種方式[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸修剪和突觸重塑上扮演著至關(guān)重要的作用[2-3]，并且研究[4-7]提示，小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的異常與帕金森病、精神分裂癥、阿爾茲海默病、孤獨(dú)癥、疼痛等許多神經(jīng)系統(tǒng)性疾病存在著密切的關(guān)系。

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是一種由140個(gè)氨基酸組成的可溶性蛋白質(zhì)，主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜，該蛋白在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)[8]、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性、多巴胺的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)等方面都發(fā)揮著重要的功能[9]。α-syn被認(rèn)定為路易小體和膠質(zhì)細(xì)胞包涵體的主要組成成分，可溶性α-syn單體會(huì)發(fā)生異常積聚形成寡聚體，進(jìn)而形成毒性的纖維體。并且α-syn的毒性作用不僅只作用于神經(jīng)元，還可以作用于鄰近的小膠質(zhì)細(xì)胞等。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，α-syn單體可激活小膠質(zhì)細(xì)胞，增加細(xì)胞吞噬能力和炎性反應(yīng)因子的釋放，該蛋白的含量異常引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的病理激活可能是相關(guān)疾病發(fā)病的原因之一。目前已有離體研究[10]顯示α-syn對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活的作用，在小膠質(zhì)細(xì)胞系過(guò)表達(dá)α-syn能夠增加腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6) 以及一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放。但α-syn單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的影響并沒(méi)有得到足夠的重視。本研究應(yīng)用原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察α-syn單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能以及溶酶體大小的影響，并進(jìn)一步對(duì)比α-syn單體對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)因子表達(dá)的影響，試圖揭示α-syn激活小膠質(zhì)細(xì)胞的主要作用，希望揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)中α-syn作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的主要途徑和作用形式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J野生型出生24 h內(nèi)乳鼠繁殖于首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部，由1只雄性和2只雌性成年小鼠合籠同居交配繁育得到，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2018-0002。取P0乳鼠全腦(除小腦)的原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，或振搖獲得原代小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)符合中華人民共和國(guó)動(dòng)物保護(hù)法，并通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中按照替代、減少和優(yōu)化的三項(xiàng)原則，盡量減少動(dòng)物使用數(shù)量和降低動(dòng)物的痛苦。

1.2 主要試劑

單體α-syn重組蛋白，購(gòu)自美國(guó)rPeptide公司；細(xì)菌脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；分化抗原68(clusters of differentiation 68，CD68)抗體購(gòu)自英國(guó)AbD Serotec公司；鈣離子結(jié)合適配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗體購(gòu)自日本W(wǎng)ako公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司。

1.3 主要儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；生物安全柜購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；共聚焦顯微鏡TCS SP8購(gòu)自德國(guó) Leica 公司；NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；QuantStudio 5 實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Vortex-T 旋渦混合器購(gòu)自美國(guó)Scientific industries公司；SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀(I3)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司。

1.4 原代細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

剝離出新生24 h內(nèi)的乳鼠的全腦(除小腦)，在體式顯微鏡下剝除腦膜和血管后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，得到混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞體系，培養(yǎng)7 d后可用于實(shí)驗(yàn)；將細(xì)胞懸液接種于多聚賴氨酸預(yù)包被的75 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于 37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的孵箱中培養(yǎng)，每2天進(jìn)行半量換液，在培養(yǎng)第14天將細(xì)胞培養(yǎng)瓶固定于37 ℃ 恒溫?fù)u床，180 r/min恒溫震蕩2 h，獲得原代小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞模型制備及分組

取得的原代小膠質(zhì)細(xì)胞按1×104的數(shù)量接種于細(xì)胞玻片上，按處理不同分為：對(duì)照組(control)、0.1、1、10 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，并在培養(yǎng)基中加入帶有紅色和綠色的熒光示蹤劑的超純聚苯乙烯微球體用于熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)；分為對(duì)照組(control)、1 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，用于CD68蛋白的表達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。將混合培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞體系按照2 mL/孔，種于6孔培養(yǎng)板，分為對(duì)照組(control)、1 μmol/L α-syn和0.1 μg/mL LPS處理組，加入藥物后作用24 h，提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞上清用于小膠質(zhì)細(xì)胞炎性激活的檢測(cè)。

1.6 免疫熒光和熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞爬片固定、打孔和封閉處理后加入一抗anti-Iba1(1∶500)和anti-CD68(1∶500)，分別加入Alexa 594 羊抗兔IgG抗體和Alexa 488羊抗鼠IgG抗體二抗避光室溫孵育1 h，Hoechst 33258染料室溫孵育5 min染細(xì)胞核；熒光封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)是在加入處理藥物孵育22 h后，每孔加入1 μm大小的熒光微球繼續(xù)培養(yǎng)2 h。固定后Hoechst 33258染料室溫孵育5 min染細(xì)胞核，熒光封片劑封片，共聚焦顯微鏡下明場(chǎng)微分干涉反差(differential interference contrast，DIC)確定單個(gè)細(xì)胞形態(tài)和輪廓，計(jì)數(shù)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光微球的數(shù)量。

1.7 實(shí)時(shí)定量(reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction， RT-qPCR)檢測(cè)TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄

RNA提?。?孔培養(yǎng)板中細(xì)胞用RNA快速提取試劑(Trizol)，室溫裂解后將裂解液移入1.5 mL 無(wú)RNA酶的離心管中，加入三氯甲烷抽提出細(xì)胞總RNA，用異丙醇將RNA進(jìn)行沉淀；漂洗后室溫進(jìn)行干燥后，用20 μL DEPC水在56 ℃ 溶解RNA，-80 ℃ 保存。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，總體系為20 μL，置于QuantStudio 5 實(shí)時(shí)定量PCR儀中按反應(yīng)條件擴(kuò)增。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)TNF-α蛋白

收集加藥處理后的細(xì)胞上清液進(jìn)行ELISA測(cè)定；先在預(yù)包被的孔板中加入 50 μL的稀釋液，再分別加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，室溫反應(yīng)2 h；用洗滌液洗板5次，拍干；在反應(yīng)孔中加入100 μL鼠TNF-α/IL-1β 結(jié)合試劑，室溫孵育2 h；用洗滌液洗板5次；反應(yīng)孔中加入100 μL 工作液，室溫避光反應(yīng)30 min；反應(yīng)孔中加入100 μL 終止液，測(cè)量450 nm的各孔吸光度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 α-syn激活小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能

為了檢測(cè)α-syn對(duì)細(xì)胞的吞噬能力的影響，對(duì)各處理組細(xì)胞內(nèi)的磁珠進(jìn)行示蹤定位和計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，不同濃度α-syn均能增加小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)1 μm熒光微球的吞噬數(shù)量，并且呈劑量依賴性。與對(duì)照組(6.900±0.690)相比，0.1 μmol/L α-syn處理組(13.250±1.115)增加了0.92倍(P=0.041 6); 1 μmol/L α-syn組(18.000±1.459)增加了1.6倍(P=0.000 2)，10 μmol/L α-syn組(21.360±1.889)增加了2.1倍(P<0.000 1)；陽(yáng)性對(duì)照(41.000±4.546)LPS組增加了4.94倍(P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。α-syn能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能增加且與LPS效果相近。詳見(jiàn)圖1。

2.2 α-syn增加CD68蛋白的表達(dá)

通過(guò)CD68染色標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體，在α-syn或LPS刺激后，CD68表達(dá)強(qiáng)度分別顯著增加了 (3.198 0±0.408 4)倍和 (2.930 0±0.673 1)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.025 0和0.041 8)，代表吞噬功能的增強(qiáng)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 α-syn可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬增加Fig.1 Phagocytosis of microglia increased after α-syn treatment

A： Representative image of a microglia that phagocytosed microspheres， blue indicates Hoechst staining and outer layers of microglia are outlined via the merged image with DIC；scalebar: 10 μm;B： The number of microspheres taken up per cell was counted， with 6-10 cells per groups. Microglia were treated with different concentrations of α-syn and LPS， and the number of microspheres that ingested in cells was counted. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，***P<0.001vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;DIC：differential interference contrast.

2.3 α-syn對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞炎性的激活

LPS刺激24 h后TNF-α蛋白的釋放增加到(612.5±228.3) 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005 8)，而各濃度α-syn處理組雖然隨劑量有增加趨勢(shì)，但增加量遠(yuǎn)低于LPS組，10 μmol/L α-syn組增加了(10.15±3.882)倍；隨后選取1 μmol/L α-syn和LPS刺激原代培養(yǎng)的混合膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，提取細(xì)胞總RNA用于檢測(cè)炎性反應(yīng)因子的轉(zhuǎn)錄水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，α-syn可以使TNF-α轉(zhuǎn)錄水平增加了(1.917±0.162 5) 倍(P=0.005 9)，IL-1β轉(zhuǎn)錄水平增加(2.937±0.568 1)倍(P=0.034 4)，然而LPS可以使TNF-α和IL-1β增加(33.80±5.883)倍(P=0.005 1)和(308.3±103.9)倍(P=0.041 7)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖3。

圖2 α-syn可以增加CD68蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of CD68 was increased by α-syn

A： Immunofluorescence of CD68 protein (green) in primary microglia and blue indicates Hoechst staining；Scale bar：25 μm；B： Quantification of the mean fluorescence intensity of CD68 in microglia. 1 μmol/L α-syn or 0.1 μg/mL LPS was added in primary cultured microglia for 24 h. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，**P<0.01vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;CD68： clusters of differentiation 68.

圖3 α-syn可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生炎性激活Fig.3 Expression of pro-inflammatory factors increased by α-syn

Primary microglia-astrocyte mixed culture prepared from the P0 mice and treated with or without α-syn or LPS. The release of TNF-α (A) in mixed microglia supernatant were detected by ELISA. mRNA level of TNF-α(B) and IL-1β (C) were detected by RT-qPCR. Data were analyzed by one-way ANOVA test.*P<0.05，**P<0.01vscontrol;α-syn： α-synuclein;LPS： lipopolysaccharides;TNF-α： tumor necrosis factor-α;IL-1β： interleukin-1 beta;GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay;RT-qPCR:reverse transcription-quantitative real-time polymerase chain reaction.

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞激活后會(huì)具有兩種最主要的功能：吞噬和炎性反應(yīng)，也是很多神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病的兩種重要危險(xiǎn)因素。小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)激活存在于多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且對(duì)于疾病的病理發(fā)生和進(jìn)程有著促進(jìn)作用。被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌出大量的促炎因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、過(guò)氧化物、一氧化氮等[11]，給予小膠質(zhì)細(xì)胞LPS刺激便可以迅速誘導(dǎo)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的生成增多[12-13]，小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。但吞噬在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用是利是弊一直存在爭(zhēng)議，小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用在清除細(xì)胞殘片和神經(jīng)元的突觸可塑性上發(fā)揮著十分重要的作用[14]。本研究中選擇LPS作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，LPS是一種常用于激活小膠質(zhì)細(xì)胞的工具藥物，其動(dòng)物模型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究中被認(rèn)為是小膠質(zhì)細(xì)胞激活的經(jīng)典模型。側(cè)腦室注射或全身注射LPS可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并伴有神經(jīng)元丟失[15-17]。體外研究[18-19]同樣證實(shí)，LPS同樣能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的迅速激活，釋放炎性因子，啟動(dòng)下游MAPK等通路。給予原代小膠質(zhì)細(xì)胞或BV2細(xì)胞系細(xì)胞LPS刺激后，檢測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的增加[20]，包括對(duì)神經(jīng)元的吞噬。因此筆者選擇了LPS作為可以明確病理性激活小膠質(zhì)細(xì)胞炎性和吞噬功能的陽(yáng)性藥物，對(duì)比觀察α-syn蛋白在炎性和吞噬兩種功能上對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度。

本研究對(duì)比觀察了帕金森病關(guān)鍵致病蛋白α-syn對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)和吞噬功能的影響，結(jié)果顯示，0.1～10 μmol/L劑量的α-syn能夠顯著升高原代小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于熒光微球的吞噬數(shù)量，按照劑量分別升高了0.92、1.62和3.10倍，0.1 μg/mL 的LPS刺激組增加了4.94倍，Park 等[21]在小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系BV2和原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞分別加入1 μmol/L α-syn，作用12 h發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)熒光微球吞噬數(shù)分別增加了2倍和1.7倍，Labuzek等[22]用1 μg/mL LPS刺激原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞24 h，細(xì)胞吞噬相對(duì)于對(duì)照組增加約4倍，結(jié)果均與本報(bào)道一致。溶酶體作為細(xì)胞的消化器官，參與吞噬的整個(gè)過(guò)程中，應(yīng)用CD68分子來(lái)標(biāo)記溶酶體，可以反映細(xì)胞吞噬功能的變化[23-24]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證α-syn小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的影響，通過(guò)CD68染色標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞溶酶體，免疫熒光染色結(jié)果提示，1 μmol/L的α-syn能夠使小膠質(zhì)細(xì)胞的CD68蛋白平均熒光強(qiáng)度增加2.2倍，高于LPS組的1.9倍。在炎性激活方面，他們發(fā)現(xiàn)在0.1、1、10 μmol/L劑量的α-syn刺激后24 h，細(xì)胞上清中釋放的TNF-α增加了0.34、1.1和9.15倍，遠(yuǎn)低于LPS處理組的增加倍數(shù)(約611.5倍)。Hee課題組[25]給予原代小膠質(zhì)細(xì)胞1、5和10 μmol/L劑量的α-syn刺激24 h，TNF-α蛋白釋放量分別增加約2、7和10倍，與本結(jié)果相一致。RT-qPCR結(jié)果顯示，1 μmol/L的α-syn使TNF-α和IL-1β轉(zhuǎn)錄水平分別增加0.9和1.9倍，然而LPS可以使TNF-α和IL-1β分別增加33.8倍和308.3倍。

以上結(jié)果提示，α-syn對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬功能的激活作用要高于對(duì)于炎性反應(yīng)的激活。Neher 等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)混合細(xì)胞體系中小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用會(huì)主動(dòng)誘導(dǎo)健康的神經(jīng)元死亡，也就是說(shuō)吞噬作用可能是神經(jīng)元死亡的原因而不是后果，并且炎性反應(yīng)在這一過(guò)程中扮演著重要的角色。因此本研究提示，α-syn主要是通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬然后引起神經(jīng)元被吞噬死亡，來(lái)產(chǎn)生致病效果。