劉玉茜，楊 瑞, ，張志平，吳丹丹，唐禹馨，徐晶晶，周中凱,

(1. 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457；3. 廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院，佛山 528216)

鐵蛋白是廣泛存在于生命體內(nèi)的一種貯鐵關(guān)鍵蛋白質(zhì)[1]．典型的鐵蛋白分子是由 24個(gè)亞基組成的中空球狀分子[2]，每兩個(gè)亞基反向平行形成一組，再由這 12組亞基對(duì)構(gòu)成一個(gè)近似正八面體，成 4-3-2重軸對(duì)稱的球狀分子[3]．一分子鐵蛋白包括 12個(gè)二重軸通道、8個(gè)三重軸通道和 6 個(gè)四重軸通道[4](圖1)．這些通道負(fù)責(zé)鐵蛋白與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，是鐵蛋白內(nèi)部與外部離子進(jìn)出鐵蛋白的必經(jīng)之路，起著溝通鐵蛋白內(nèi)部空腔與外部環(huán)境的作用[5]．

鐵蛋白的鐵還原釋放現(xiàn)象是指當(dāng)細(xì)胞需要鐵時(shí)(Fe2+濃度低)，鐵蛋白在還原劑的幫助下將儲(chǔ)存于鐵蛋白內(nèi)部空腔內(nèi)的Fe3+還原為Fe2+，使鐵釋放出來并轉(zhuǎn)移到鐵蛋白外部供機(jī)體利用的過程，釋放的快慢與還原劑的濃度、蛋白的種類以及溶液 pH有很大關(guān)系[6]．研究鐵蛋白的鐵還原釋放是了解鐵蛋白鐵代謝途徑及其機(jī)理的重要手段之一，同時(shí)也為了進(jìn)一步闡明鐵蛋白的性質(zhì)，為開發(fā)新型天然補(bǔ)鐵功能產(chǎn)品提供良好的基礎(chǔ)資料．目前，對(duì)于鐵蛋白的鐵吸收途徑研究比較清楚，由于鐵蛋白的鐵釋放過程比較復(fù)雜，無法采用簡單動(dòng)力學(xué)公式闡明鐵還原釋放全過程及其規(guī)律[7]，因而相關(guān)的研究進(jìn)展報(bào)道并不多．

圖1 鐵蛋白殼狀結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Ferritin structure

本實(shí)驗(yàn)中利用食源活性小分子表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、維生素 C(VC)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)3種還原成分，研究食品多組分分子對(duì)鐵的還原釋放的影響．其中：EGCG是從綠茶中提取出的一種抗氧化極強(qiáng)的多酚類物質(zhì)．VC是食品工業(yè)中非常常用的活性組分，是一種高活性物質(zhì)和抗氧化劑，能使難以吸收的三價(jià)鐵還原為易吸收的二價(jià)鐵，促進(jìn)了鐵的吸收．實(shí)驗(yàn)中另一種原料 NADH為還原態(tài)，具有將三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵的性質(zhì)[8]．這 3種成分均為還原性分子，但是其相對(duì)分子質(zhì)量大小和性質(zhì)各不相同，它們對(duì)鐵還原釋放的影響非常值得研究．

1 材料與方法

1.1 材料

重組 H-2亞基鐵蛋白(rH-2)大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)表達(dá)菌株(菌液，實(shí)驗(yàn)室保存)；胰蛋白胨、酵母抽提物，上海富雪生物科技有限公司；NaCl、NaOH，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；HCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaN3，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；過硫酸銨，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán) R-250、硫酸亞鐵(FeSO4)、金屬螯合劑菲洛嗪(Ferrozine)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、維生素 C(VC)、NADH、氨卡青霉素(AMP)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(分析純)、蛋白 marker(分析純)、牛血清白蛋白(BSA)(分析純)、福林酚，北京索萊寶科技有限公司；溴酚藍(lán)、四甲基乙二胺(TEMED)，上海北諾生物科技有限公司；β-巰基乙醇，美國 Amresco公司；丙烯葡聚糖凝膠 Sephacryl S-300(分析純)，江西豐臨醫(yī)用器械有限公司；硫酸銨(分析純)，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純．

TGL-16A型醫(yī)用離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；K36616D型微量移液器，德國 Eppendorf公司；DYY-2C型電泳槽，北京市六一儀器廠；EMS-19型磁力攪拌器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；SCIENTZ-D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-9146MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DV-908型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SIM-F140AY65-PC型制冰機(jī)，松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；BS-100A型自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠；89090A型紫外分光光度計(jì)，Agilent公司．

1.2 重組H-2亞基鐵蛋白(rH-2)的制備與純化

1.2.1 rH-2的制備

rH-2的制備在 Masuda等[9]的方法上稍作修改.將含有 rH-2目的基因表達(dá)載體的大腸桿菌(E．coli)接種至含50μg/mL AMP的 LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)．當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞濃度達(dá)到 A600＝0.6時(shí)，加入工作濃度為100μmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，37℃搖床培養(yǎng)12～14 h；4℃、10 278 r/min離心15 min，取沉淀.將收集得到的沉淀菌體懸浮于純凈水中，將菌體進(jìn)行超聲破碎20 min，超聲時(shí)間為2 s，工作間隔為 2.5 s．超聲后菌液4℃、10000g離心15min，收集上清液于50℃水浴加熱10 min，4℃、10 278 r/min再次離心15min，取上清液．在上清液中加入 40%硫酸銨鹽析沉淀，在4℃層析柜中靜置過夜．4℃、10278r/min離心15 min，收集沉淀，將沉淀用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L NaCl)進(jìn)行復(fù)溶即可得到 rH-2粗蛋白．使用 Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，20mmol/L)透析 rH-2粗蛋白，每隔 6h 換一次緩沖液，透析 3次除去硫酸銨．最后將透析后得到的蛋白溶液用0.22μm水系膜過濾．

1.2.2 rH-2的純化與表征

將粗蛋白進(jìn)行凝膠柱層析，上樣前均需過0.22μm 濾膜．用含 0.15mol/L NaCl的 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡Sephacryl S-300柱，待凝膠柱平衡后，取樣品上樣后再洗脫，流量為0.5mL/min，每管5mL收集樣品，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白純度．蛋白純化過程均在4℃下低溫操作．最后將純化的 rH-2蛋白超濾濃縮后置于 4℃?zhèn)溆茫?/p>

參照 Laemmli[10]方法，采用 SDS-PAGE電泳測(cè)定分離純化后的rH-2的純度．其中SDS-PAGE 電泳蛋白質(zhì) marker相對(duì)分子質(zhì)量：磷酸化酶 B 9.74×104，牛血清清蛋白 6.62×104，兔肌動(dòng)蛋白 4.30×104，牛碳酸酐酶 3.10×104，胰酶抑制劑 2.01×104，溶菌酶 1.44×104．凝膠為 4%～20%梯度膠，膠板大小為 80mm(W)×73mm(H)×0.75mm(T)．每孔點(diǎn)樣 10μL，marker 6μL．電泳在 17mA 恒流下進(jìn)行，電泳完成后用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色．

1.2.3 rH-2鐵蛋白濃度的測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定參照 Lowry法[11]，以牛血清蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取6支1.5mL離心管，編號(hào)后分別加入 0、20、40、60、80、100μL 0.5mg/mL BSA，用蒸餾水補(bǔ)足 400μL，使每管蛋白含量分別為 0、10、20、30、40、50μg，每支離心管中加入 400μL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白工作液，劇烈震蕩后靜置10min．繼續(xù)加入20%福林酚 200μL，立即混勻，室溫下靜置 30min．用石英比色皿測(cè)定 750nm 處吸光度 A750，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其方程為y＝0.009x+0.0958，R2＝0.9787．

樣品測(cè)定：根據(jù)溶液蛋白濃度的高低，選擇合適的加樣量，每樣作 3個(gè)平行．用超純水補(bǔ)足 400μL．后續(xù)處理同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制．根據(jù)吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出比色液中蛋白質(zhì)含量．

1.3 rH-2鐵蛋白還原釋放動(dòng)力學(xué)測(cè)定

菲洛嗪是一種螯合劑，當(dāng)其遇到 Fe2+時(shí)，相互結(jié)合形成螯合物[Fe(ferrozine)3]2+，這種螯合物在562nm波長處有紫外吸收，其紫外吸收強(qiáng)度可以間接判斷 Fe2+的釋放量[12]．反應(yīng)在 25℃下進(jìn)行，以不加還原劑的體系作為空白對(duì)照．

FeSO4溶液的配制：用濃硫酸配制50mL pH 2.0的酸化水．稱取 0.0834g FeSO4溶于酸化水中，定容，配制成 50mL濃度為 6mmol/L的 FeSO4母液，搖勻后避光保存．

螯合劑溶液的配制：稱取 0.04924g菲洛嗪溶于1mL的蒸餾水中，配制成 0.1mol/L的菲洛嗪母液，搖勻后避光保存．

在 rH-2的提取過程中，從大腸桿菌生長和表達(dá)的培養(yǎng)基至蛋白的提取純化過程都沒有鐵離子的加入，所以制備出來的鐵蛋白是不含鐵的空蛋白[9]．因此，參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法先將純化得到的 rH-2制備成含鐵的鐵蛋白，然后再對(duì)制備的 rH-2含鐵鐵蛋白進(jìn)行還原釋放動(dòng)力學(xué)測(cè)定[14]．

1.3.1 EGCG對(duì)鐵蛋白還原釋放的影響

取 4支 1.5mL的離心管，分別加入 1mL濃度為 1μmol/L 的鐵蛋白溶液，再分別加入不同體積的濃度為 6mmol/L的 FeSO4溶液，使 Fe2+與鐵蛋白的終濃度比分別為 600∶1、400∶1、200∶1、100∶1，避光搖勻，靜置10min后加入濃度為0.1mol/L的菲洛嗪溶液 10μL，充分搖勻后，加入比色皿中．再加入相同體積的濃度為 1.0mmol/L的 EGCG溶液，使得EGCG 與鐵蛋白濃度比均為 220∶1，在 25℃、562nm下進(jìn)行測(cè)定，觀察紫外強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，每個(gè)樣本運(yùn)行1800s，循環(huán)時(shí)間0.5s．

分別固定 Fe2+與鐵蛋白的濃度比為 600∶1，加入濃度為0.1 mol/L的菲洛嗪溶液10μL，充分搖勻后，加入比色皿中．再加入不同體積的濃度為1.0mmol/L的EGCG溶液，使得EGCG與鐵蛋白的終濃度比分別為 20∶1、60∶1、100∶1、140∶1、180∶1、220∶1、260∶1．在 25℃、562nm 處進(jìn)行測(cè)定，觀察紫外強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，每個(gè)樣本運(yùn)行1800s，循環(huán)時(shí)間 0.5s．

1.3.2 VC對(duì)鐵蛋白還原釋放的影響

依照1.3.1節(jié)相同的操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察VC對(duì)鐵蛋白還原釋放的影響．

1.3.3 NADH對(duì)鐵蛋白還原釋放的影響

實(shí)驗(yàn)操作方法同1.3.1節(jié)，觀察NADH對(duì)鐵蛋白還原釋放的影響．

2 結(jié)果與討論

2.1 rH-2的制備與表征

將純化后的蛋白通過 SDS-PAGE進(jìn)行純度鑒定和亞基相對(duì)分子質(zhì)量確定，結(jié)果如圖 2所示．SDSPAGE電泳圖表明純化后的rH-2在2.8×104處呈現(xiàn)單一條帶，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道相符．雖然純化后的 rH-2有少量的雜帶，但其純度符合實(shí)驗(yàn)要求．

圖2 rH-2的SDS-PAGE電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE of rH-2

2.2 EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

鐵蛋白的三重軸通道具有亞鐵氧化酶活性位點(diǎn)，外源添加的 Fe2+在氧氣存在的情況下會(huì)被該活性位點(diǎn)中心氧化成 Fe3+并儲(chǔ)藏在鐵蛋白內(nèi)部[1,4]，該結(jié)論已被廣泛報(bào)道．在還原劑(如 VC、EGCG)的存在下，在植物鐵蛋白內(nèi)儲(chǔ)存在鐵蛋白內(nèi)部的 Fe3+能通過四重軸通道被還原釋放出鐵蛋白[16]．EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線如圖3所示．

當(dāng)還原劑 EGCG與鐵蛋白濃度比為 220∶1時(shí)(圖 3(a))，且 Fe2+與鐵蛋白濃度比為 100∶1時(shí)，隨著時(shí)間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時(shí)間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時(shí)，隨著 Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，吸光度增加速率也呈遞增趨勢(shì)，其原因可能是 EGCG具有很強(qiáng)的還原性，且可以直接進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔，使鐵核中Fe3+還原成Fe2+并釋放出來[16]，而且隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的增加，在相同濃度的還原劑 EGCG存在條件下，有更多的 Fe3+被還原成 Fe2+，因此吸光度值越來越大．

當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1時(shí)(圖 3(b))，隨著 EGCG與鐵蛋白濃度比的增加，吸光度在相同的時(shí)間范圍內(nèi)，增加程度呈上升趨勢(shì)，表明 Fe2+釋放速率升高．其原因可能是由于 EGCG分子質(zhì)量相對(duì)較小，可以通過四重軸通道直接進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔[17-18]，加之具有很強(qiáng)的還原性，所以隨著EGCG濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增．EGCG 誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放的研究表明，鐵蛋白中鐵的釋放速率同時(shí)受 Fe2+裝載量和還原劑 EGCG 濃度的影響，并且與這兩種影響因素成正比關(guān)系．

圖3 EGCG誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線圖Fig. 3 EGCG induced changes in the reduction and release of ferritin

2.3 VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線如圖 4所示．圖 4(a)表明：當(dāng)還原劑 VC與鐵蛋白濃度比為220∶1、Fe2+與鐵蛋白濃度比為 100∶1時(shí)，吸光度隨時(shí)間的增加而逐漸增加，但在相同的時(shí)間范圍內(nèi)，增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時(shí)，隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，吸光度增加速率也呈遞增趨勢(shì)．其原因可能是 VC具有很強(qiáng)的還原性，能進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔[19]，將鐵核中Fe3+還原成Fe2+并釋放出來，且在相同濃度的還原劑 VC存在條件下，隨著Fe2+濃度的增加，有更多的 Fe3+被還原成 Fe2+，從而吸光度越來越大．圖4(b)表明：當(dāng)Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1、VC與鐵蛋白濃度比為 20∶1時(shí)，隨著時(shí)間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時(shí)間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時(shí)，隨著VC與鐵蛋白濃度比的增加，相同的時(shí)間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸上升，表明 Fe2+釋放速率升高．其原因可能是由于 VC相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)較小，可以通過四重軸通道直接進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔，加之具有很強(qiáng)的還原性，所以隨著 VC濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增[19]．因此，得出與 2.2節(jié)類似的結(jié)論，除 Fe2+裝載量外，還原劑 VC濃度也影響鐵的釋放速率，且與這種影響因素也成正比關(guān)系．

圖4 VC誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放變化曲線圖Fig. 4 VC induced changes in the reduction and release of ferritin

2.4 NADH誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放

Fe2+與鐵蛋白濃度比為600∶1時(shí)，鐵蛋白受不同濃度的NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線如圖5所示．

圖5 Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1時(shí)，鐵蛋白受不同濃度的NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線圖Fig. 5 Reduction and release curves of ferritin induced by different concentrations of NADH when Fe2+/ferritin＝600∶1

當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1、NADH 與鐵蛋白濃度比為 20∶1時(shí)，隨著時(shí)間的推移，吸光度逐漸增加，但是相同的時(shí)間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸降低，表明 Fe2+釋放速率降低．同時(shí)，隨著 NADH與鐵蛋白濃度比的增加，相同的時(shí)間范圍內(nèi)，其增加程度逐漸上升，表明 Fe2+釋放速率升高．其可能的原因是由于 NADH具有很強(qiáng)的還原性，本身的分子質(zhì)量相對(duì)比較大，不能直接進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔，但能在鐵蛋白表面進(jìn)行相互作用，從而產(chǎn)生能量振動(dòng)轉(zhuǎn)移，使鐵核中 Fe3+還原成 Fe2+并釋放出來，所以隨著時(shí)間的增加，吸光度逐漸增大．隨著 NADH濃度的增加，被還原釋放出的 Fe2+也增加，從而導(dǎo)致吸光度越來越大，F(xiàn)e2+釋放的速率也遞增[19]．

2.5 VC、EGCG和NADH誘導(dǎo)鐵蛋白還原釋放的比較分析

鐵蛋白受VC、EGCG、NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線對(duì)比結(jié)果如圖 6所示．當(dāng) Fe2+與鐵蛋白濃度比為 600∶1，VC、EGCG、NADH 與鐵蛋白濃度比均為220∶1時(shí)，隨著時(shí)間的增加，吸光度均逐漸增加，吸光度上升斜率逐漸降低，但是 EGCG、VC和 NADH還原釋放 Fe2+的速率并不相同．VC誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升最快，持續(xù)時(shí)間最長，NADH誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升最慢，持續(xù)時(shí)間最短．其可能原因是：由于EGCG和VC都是相對(duì)分子質(zhì)量較小并且還原性很強(qiáng)的活性物質(zhì)，均可以進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔；但不同的是，由于 EGCG 的還原性比 VC更大，所以在反應(yīng)初期，EGCG誘導(dǎo)的還原釋放速率比 VC高．但是，因?yàn)?VC的相對(duì)分子質(zhì)量比 EGCG 更小，VC比 EGCG更容易進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，鐵蛋白空腔內(nèi)的 VC濃度增加比 EGCG大，從而導(dǎo)致 VC誘導(dǎo)的還原釋放速率持續(xù)增加時(shí)間比EGCG長．

圖6 鐵蛋白受 VC、EGCG、NADH誘導(dǎo)還原釋放變化曲線對(duì)比圖Fig. 6 Contrast of reduction and release of ferritin induced by VC，EGCG and NADH

然而，NADH相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)比較大，不可以直接進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)腔，只能與鐵蛋白表面進(jìn)行相互作用并結(jié)合為復(fù)合物，從而產(chǎn)生能量振動(dòng)轉(zhuǎn)移，使鐵核中 Fe3+還原成 Fe2+并釋放出來．這說明 NADH 誘導(dǎo)的鐵還原釋放是通過蛋白殼上的電子傳遞鏈進(jìn)行的，并推斷該電子傳遞鏈存在于四重軸通道上[19]．由于能量振動(dòng)轉(zhuǎn)移過程需要時(shí)間，所以使得 Fe3+還原成Fe2+的速率相對(duì)EGCG和VC減小．

3 結(jié) 論

EGCG、VC和 NADH這 3種食源還原成分都能誘導(dǎo)重組鐵蛋白 rH-2中鐵的還原釋放．其中：隨著Fe2+與鐵蛋白濃度比的遞增，VC和 EGCG 對(duì)鐵的還原釋放呈遞增趨勢(shì)，并且 VC和 EGCG在裝載相同F(xiàn)e2+濃度的情況下，隨著還原劑濃度的升高，其誘導(dǎo)的還原釋放速率也上升，VC相對(duì)于 EGCG誘導(dǎo)的還原釋放速率更大，持續(xù)時(shí)間更長．NADH誘導(dǎo)的還原釋放整體吸光度上升速率最慢，持續(xù)時(shí)間最短．該研究對(duì)于提高鐵蛋白-食源組分相互作用的認(rèn)識(shí)具有重要意義，同時(shí)也可為開發(fā)基于鐵蛋白的產(chǎn)品提供理論參考．