俞詩(shī)源,何玲慧,朱嘉寧,陳 誠(chéng),王小勇*
(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)
海洛因(Heroin),學(xué)名二乙酰嗎啡(Diacetylmorphine hydrochloride),具有嗎啡的鎮(zhèn)痛和麻醉功能,易成癮.海洛因溶于水,脂溶性強(qiáng),吸收、擴(kuò)散快,進(jìn)入體內(nèi)作用強(qiáng)、起效快,能很快透過(guò)血腦屏障與腦內(nèi)相應(yīng)的受體結(jié)合而產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性反應(yīng).海洛因可導(dǎo)致呼吸抑制引起腦缺血缺氧,發(fā)生腦水腫而致神經(jīng)元損傷和消失[1].如果妊娠期女性或哺乳期女性吸食海洛因有可能影響胎兒或嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育,如果子宮內(nèi)海洛因暴露可引起新生兒發(fā)育遲緩和神經(jīng)行為損傷,導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知行為缺陷[2-3].
有研究顯示海洛因可使小鼠下丘腦和海馬組織結(jié)構(gòu)受損[4],但阿片類(lèi)毒品是否通過(guò)母鼠胎盤(pán)影響仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)和抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)鮮有研究.為了研究妊娠期女性或哺乳期女性吸食興奮劑對(duì)嬰幼兒小腦組織結(jié)構(gòu)及抗氧化酶活力的影響,文中以昆明小鼠為模型,給孕鼠注射不同劑量的海洛因溶液,通過(guò)觀察其仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)和過(guò)氧化氫酶活性以及谷胱甘肽、丙二醛含量的變化,分析探討孕鼠使用興奮劑后對(duì)仔鼠器官功能的影響.
鹽酸海洛因(甘肅省公安廳提供)用蒸餾水配制成2,4和6 g·L-1濃度梯度的水溶液(根據(jù)小鼠半數(shù)致死劑量和成癮劑量配制而成[4]),4 ℃下保存?zhèn)溆茫入赘孰?GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所.
選昆明小鼠96只(蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供,體重30~40 g),按雌雄小鼠1∶1合籠交配,次日早晨做雌鼠陰道檢查,出現(xiàn)陰栓或精子涂片觀察到精子即記為妊娠第1 d.48例受孕小鼠隨機(jī)分為4組(對(duì)照組和海洛因1,2,3組,每組12只).各海洛因組孕小鼠從受孕第9天開(kāi)始腹腔分別注射2,4,6 g·L-1的海洛因溶液0.2 mL,每天2次(9:30,16:30),直到孕鼠分娩后第15 d,對(duì)照組注射等量生理鹽水.分別在仔鼠出生后第5,10,15 d用電子天平稱(chēng)量仔鼠體重后,斷頭處死[5],再迅速取仔鼠小腦在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗后稱(chēng)重,左半小腦入-20 ℃冰箱凍存,右半小腦入15%的福爾馬林液中固定備用.
分別取上述凍存的各組仔鼠小腦組織塊,精確稱(chēng)重后,滴加小腦組織重量9倍的生理鹽水,冰浴勻漿5 min,制成10%的組織勻漿,用高速冷凍離心機(jī)(TGL.16 M型,Beckman公司,美國(guó))3 000 r·min-1離心10 min,用微量移液器吸取上清液,按照試劑盒的操作要求,用V-5000可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)在420,405,532 nm檢測(cè)GSH、CAT及MDA的吸光度值.
將福爾馬林液中固定的各組仔鼠小腦組織塊常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片(厚度6 μm),HE染色,光學(xué)顯微鏡(Nikon HFX-ⅡA)下觀察并攝片.
用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.
由圖1和圖2(不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著,下同)可知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠的體重、小腦重均有不同程度降低.海洛因劑量越大,仔鼠體重、小腦重下降越多,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).由圖3知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠出生5 d時(shí)小腦指數(shù)略有升高,但10 d,15 d時(shí)均低于對(duì)照組(P<0.05).
圖1 海洛因?qū)ψ惺篌w重的影響
由圖4~6可知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠小腦組織CAT活性及GSH含量均有不同程度的降低,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05),而仔鼠小腦組織MDA含量則升高,與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).
圖2 海洛因?qū)ψ惺笮∧X重的影響
圖3 海洛因?qū)ψ惺笮∧X指數(shù)的影響
圖4 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織過(guò)氧化氫酶活性的影響
圖5 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織谷胱甘肽含量的影響
圖6 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織丙二醛含量的影響
給孕鼠注射海洛因后對(duì)仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖7.研究結(jié)果顯示,對(duì)照組仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)完整清晰,界限分明,細(xì)胞排列整齊,染色正常(圖7A).孕鼠連續(xù)注射海洛因后,仔鼠小腦組織出現(xiàn)不同程度的病理性變化,細(xì)胞排列疏松而凌亂,細(xì)胞界限不清,浦肯野細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、凝集等異常改變或細(xì)胞空泡化和凋亡等現(xiàn)象(圖7B~D).
A.對(duì)照組10 d小腦皮層,HE染色,下同;B.2 g·L-1海洛因組10 d小腦皮層;C.4 g·L-1海洛因組10 d小腦皮層;D.6 g·L-1海洛因組15 d小腦皮層, 標(biāo)尺=30 μm;ML.分子層;PC.浦肯野細(xì)胞層;GC.顆粒細(xì)胞層,標(biāo)尺=30 μm
圖7 仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)的變化
Fig 7The changes of cerebellum histological structure in newborn mice
小腦參與調(diào)節(jié)軀體平衡和肌肉張力、協(xié)調(diào)機(jī)體的隨意運(yùn)動(dòng),如果損傷小腦,機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)供給失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)等多種癥狀[6],海洛因作用于阿片受體通過(guò)釋放內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)或形成復(fù)合物,可造成腦部多個(gè)區(qū)域損傷[7].長(zhǎng)期使用興奮劑機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)及其功能將受到極大的影響,激素分泌受到抑制,造成機(jī)體生長(zhǎng)遲緩[7],影響動(dòng)物下丘腦攝食中樞的發(fā)育及功能,影響動(dòng)物的食欲,導(dǎo)致食量減少,影響機(jī)體的發(fā)育和體重及器官重量[8].本實(shí)驗(yàn)各期海洛因組仔鼠體重和小腦重均低于對(duì)照組,可能是因?yàn)楹B逡蛲ㄟ^(guò)胎盤(pán)屏障或乳汁進(jìn)入仔鼠體內(nèi),再通過(guò)血腦屏障,直接作用于發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞,影響神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和仔鼠的行為,導(dǎo)致小鼠興奮性增強(qiáng),疲勞感消失,睡眠減少,活動(dòng)量加大,增加了機(jī)體物質(zhì)的消耗,使得動(dòng)物生長(zhǎng)遲緩,海洛因的毒性作用亦可能干擾了體內(nèi)能量代謝過(guò)程,造成代謝紊亂[9],影響動(dòng)物的食欲,使得動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不足,導(dǎo)致體重和器官重量下降及器官指數(shù)下降.
GSH、CAT是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分.CAT具有清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用,GSH可與H2O2反應(yīng)生成H2O,通過(guò)減少H2O2含量來(lái)消除·OH的生成,對(duì)機(jī)體細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整有重要的保護(hù)作用.MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出的反應(yīng)性醛,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死,其含量的高低反映機(jī)體細(xì)胞遭受自由基攻擊的程度[14].海洛因、可卡因及安非他明等可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,引起神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死[7,15,16].有研究顯示麻黃素可使肺組織[17]、心肌細(xì)胞[18]、肝[19]、卵巢[20]、腎[21]組織發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷使組織中的抗氧化物酶活性降低,MDA含量升高.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給孕鼠注射海洛因后仔鼠小腦組織CAT活力和GSH含量下降,MDA含量上升,表明孕鼠注射海洛因影響仔鼠小腦組織的抗氧化能力,會(huì)影響小腦的結(jié)構(gòu)與功能.
海洛因可與體內(nèi)內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合阿片受體,如果長(zhǎng)時(shí)間使用海洛因會(huì)導(dǎo)致機(jī)體興奮劑依賴(lài).海洛因可通過(guò)血腦屏障,直接抑制呼吸中樞,造成機(jī)體呼吸抑制,導(dǎo)致機(jī)體缺氧,出現(xiàn)全身缺血缺氧,促使機(jī)體器官損傷,損害腦細(xì)胞,影響人的學(xué)習(xí)、記憶、情感、情緒等功能活動(dòng)[22-24],有研究顯示麻黃素可使小鼠下丘腦、海馬[25]、大腦額葉[26]組織結(jié)構(gòu)受損.本實(shí)驗(yàn)顯示孕鼠注射海洛因影響仔鼠的體重和小腦重量及小腦指數(shù),仔鼠小腦組織出現(xiàn)不同程度的病理性變化,細(xì)胞排列疏松而凌亂,細(xì)胞界限不清,浦肯野細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、凝聚等異常改變或細(xì)胞空泡化和凋亡現(xiàn)象等,這可能是孕鼠注射海洛因后,后者通過(guò)胎盤(pán)屏障或乳汁進(jìn)入仔鼠體內(nèi)影響了仔鼠腦的結(jié)構(gòu)與功能,表明母鼠使用海洛因影響仔鼠小腦的組織結(jié)構(gòu).
綜上所述,母鼠注射海洛因,可能通過(guò)胎盤(pán)屏障或乳汁進(jìn)入仔鼠體內(nèi),再通過(guò)血腦屏障,直接作用于發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞,使仔鼠機(jī)體重量、器官重量及器官指數(shù)降低,影響仔鼠腦組織抗氧化酶活性,對(duì)仔鼠腦組織有明顯的損傷作用,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討.