梁麗麗，苑 星，劉 新，崔秀琴，高 謙

(1.河南省胸科醫(yī)院內(nèi)六科，河南 鄭州 450000；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)核內(nèi)二科，河南 衛(wèi)輝 453100；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院教育部分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032)

結(jié)核病是威脅全世界的公共衛(wèi)生問題，是2016年全球九大死亡原因之一，因結(jié)核病而死亡的人數(shù)居傳染病死亡人數(shù)之首[1]。耐藥結(jié)核病是結(jié)核病防控的難點和重點，世界衛(wèi)生組織最新耐藥結(jié)核病治療指南建議將氟喹諾酮類(fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)藥物作為抗結(jié)核治療方案的核心藥物之一[2]。FQs藥物對結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的殺菌機制是作用于由gyrA、gyrB基因編碼的2個A亞基和B亞基組成的DNA解旋酶，通過影響DNA復(fù)制而產(chǎn)生殺滅MTB的效果，MTB對FQs藥物產(chǎn)生耐藥的分子機制是gyrA、gyrB基因的氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region，QRDR)發(fā)生突變[3]。但不同的FQs藥物及不同地區(qū)FQs藥物主要的耐藥基因及突變位點均不同，本研究旨在了解鄭州地區(qū)耐多藥(multi-drug resistant，MDR)肺結(jié)核患者對FQs藥物的耐藥情況，分析MDR MTB對FQs藥物耐藥的耐藥基因和突變位點，并與藥物敏感性試驗進行對比，篩選出判斷MDR MTB對FQs藥物耐藥敏感性和特異性更高的耐藥基因及位點，以指導(dǎo)臨床合理應(yīng)用FQs藥物治療MDR肺結(jié)核?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料采用雙盲、前瞻性的臨床研究方法，收集2015年5月至2016年12月河南省胸科醫(yī)院收治的肺結(jié)核患者256例為研究對象，其中男189例，女67例，年齡18～82(44.1±16.5)歲，均根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準中肺結(jié)核診斷標準確診[4]。納入標準：(1)年滿18歲；(2)臨床確診肺結(jié)核(包括初治和復(fù)治患者)；(3)愿意在入組時提供足量痰標本；(4)已簽署知情同意書。排除標準：無法提供足量痰標本者。本研究在美國臨床試驗注冊網(wǎng)站(clinicaltrials.gov)注冊(注冊號：NCT02251327)并通過河南省胸科醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑與儀器MGIT液體培養(yǎng)管、BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)系統(tǒng)、分枝桿菌藥物敏感性試劑盒均購自美國Becton Dickinson公司，羅氏培養(yǎng)基購自珠海貝索生物有限公司，異煙肼(isoniazide，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、氧氟沙星(ofloxacin，Ofx)、莫西沙星(moifloxacin，Mfx)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司，TE緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司，2×Taq Master Mix和 DNA純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；超低溫冰箱(日本三洋公司)，聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(杭州博日科技有限公司)。

1.3標本采集及處理所有患者均在入組時留取至少2 mL痰標本。將標本進行MTB固體羅氏培養(yǎng)、液體分枝桿菌培養(yǎng)。培養(yǎng)陽性的MTB菌液分為2個部分，一部分進行藥物敏感性試驗，另一部分 -80 ℃ 保存?zhèn)溆谩Ｋ信囵B(yǎng)、藥物敏感性試驗均按相關(guān)的標準化程序進行操作[5]。藥物敏感性試驗中培養(yǎng)基藥物終濃度如下：INH 0.4 mg·L-1，RFP 40.0 mg·L-1，Ofx 2.0 mg·L-1，Mfx 0.5 mg·L-1(Mfx 0.5)，Mfx 2.0 mg·L-1(Mfx 2.0)。藥物敏感性結(jié)果判定：耐藥百分比(含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)/對照培養(yǎng)基上菌落數(shù)×100%)>1%者為MTB對該抗結(jié)核藥物耐藥。對INH和RFP同時耐藥的菌株則為MDR MTB。

1.4MDRMTBDNA模板的制備將藥物敏感性試驗確定為MDR MTB者所對應(yīng)的保存菌株從 -80 ℃ 復(fù)蘇，重新進行液體分枝桿菌培養(yǎng)，從有MDR MTB生長的培養(yǎng)基中取MDR MTB菌落轉(zhuǎn)移至含 1 mL 生理鹽水的Eppendorf離心管中，80 ℃ 30 min滅活，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，將菌體沉淀加入500 μL TE緩沖液充分懸浮，沸水浴 10 min，迅速置冰上2 min，12 000 r·min-1離心 10 min，上清液即為DNA模板溶液。將上清液樣本按編號順序排列，吸取DNA溶液置于8連排管中，每3排的第8個樣本設(shè)1個陽性對照(已知突變的樣本)。

1.5MDRMTB的PCR擴增及測序使用PCR引物擴增MDR MTB的gyrA、gyrB基因。PCR反應(yīng)體系為50.0 μL，其中2×Taq Master Mix 25.0 μL，引物3.0 μL，DMSO 1.5 μL，DNA模板3.0 μL，蒸餾水 17.5 μL。gyrA引物序列：5′-GGCCGTCGTAGTTAGGGATG-3′，gyrB引物序列：5′-GACGCGAAAGT-CGTTGTGAA-3′。PCR擴增條件為95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性20 s、54 ℃退火40 s、72 ℃延伸 2 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。擴增后的PCR產(chǎn)物均為320個堿基對，送上海桑尼生物科技有限公司進行純化和測序。

1.6應(yīng)用基因突變判斷MDRMTB對FQs藥物耐藥的敏感性和特異性應(yīng)用ClustalW(歐洲生物信息研究所)序列對比軟件，將擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果與標準MTB菌株H37Rv的gyrA和gyrB基因序列進行比對，若與標準MTB菌株序列相同，則gyrA和gyrB基因無突變，即為野生株；若序列不同，則證實gyrA和gyrB基因突變，即為耐藥株。記錄所有耐藥株的突變類型和突變位點，以該菌株的FQs藥物敏感性試驗結(jié)果為金標準，可得出應(yīng)用gyrA和gyrB基因突變判斷MDR MTB對FQs藥物耐藥的敏感性和特異性。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行分析，計數(shù)資料進行χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTB培養(yǎng)陽性者的抗結(jié)核藥物耐藥情況256例患者中，MTB培養(yǎng)陽性215例，其中初治患者80例，復(fù)治患者135例；非MDR肺結(jié)核患者137例，MDR肺結(jié)核患者78例(77例為復(fù)治患者，1例為初治患者)。137株非MDR MTB臨床分離株中，對FQs藥物耐藥10株，其中對Ofx耐藥10株，對Mfx耐藥8株，對Mfx2.0耐藥1株。78株MDR MTB臨床分離株中，對FQs藥物耐藥45株，其中對Ofx耐藥43株，對Mfx 0.5耐藥43株，對Mfx 2.0耐藥25株。非MDR MTB臨床分離株對Ofx、Mfx 0.5、Mfx 2.0的耐藥率顯著低于MDR MTB臨床分離株(χ2=61.21、66.73、45.87，P<0.001)，見表1。

表1215例MTB培養(yǎng)陽性肺結(jié)核患者MTB臨床分離株藥物敏感性試驗結(jié)果

Tab.1Drugresistanceofphenotypedrugsensitivitytestresultsin215pulmonarytuberculosispatientswithpositiveMTBculture

株別nINH耐藥/株(%)RFP耐藥/株(%)Ofx耐藥/株(%)Mfx 0.5耐藥/株(%)Mfx 2.0耐藥/株(%)MDR MTB7878(100.0)78(100.0)43(55.1)43(55.1)25(32.1)非MDR MTB13719(13.9)8(5.8)10(7.3)8(5.8)1(0.7)χ2148.90183.6061.2166.7345.87 P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.2對Ofx及Mfx耐藥的MDRMTB基因突變類型與突變位點結(jié)果見表2。43株對Ofx耐藥的MDR MTB中，39株(90.7%)gyrA基因突變，5株(11.6%)gyrB基因突變；43株對Mfx 0.5耐藥的MDR MTB中，38株(88.4%)gyrA基因突變，5株(11.6%)gyrB基因突變；25株對Mfx 2.0耐藥的MDR MTB中，25株(100.0%)gyrA基因突變，3株(12.0%)gyrB基因突變。

45株對FQs藥物耐藥的MDR MTB經(jīng)基因測序發(fā)現(xiàn)，gyrA基因突變分布于90、91、94位點，涉及3個密碼子，7種突變類型，其中94位點突變最多；gyrB基因突變分布于534、539、540、543、551位點，涉及5個密碼子，5種突變類型，突變位點分布均勻。gyrA基因94位點突變26株，藥物敏感性試驗證實對Ofx、Mfx 0.5耐藥26株(100.0%)，對Mfx 2.0耐藥19株(73.1%)。gyrA基因91位點突變5株，藥物敏感性試驗證實對Ofx、Mfx 0.5耐藥5株(100.0%)，對Mfx 2.0耐藥3株(60.0%)。gyrA基因90位點突變11株，藥物敏感性試驗證實對Ofx耐藥8株(72.7%)，對Mfx 0.5耐藥7株(63.6%)，對Mfx 2.0耐藥4株(36.4%)。43株Mfx耐藥的gyrA基因突變株中，發(fā)現(xiàn)5株雙突變株，其中包括2株A90V+S91P、1株A90V+D94N、1株A90V+D94Y、1株D94N+D94Y。

表2MDRMTB的藥物敏感性試驗及gyrA、gyrB基因測序結(jié)果

Tab.2ResultsofdrugsensitivitytestandthesequencingresultsofgyrA，gryBgenesinMDRMTB

藥物敏感性類型ngyrA基因突變類型菌株數(shù)gyrB基因突變類型菌株數(shù)Ofx敏感35WT31WT32A90V(GCG→GTG)4aG551R(GGG→AGG)2aA100T(GCC→ACC)1T539N(ACC→AAC)1P5195(CCG→TCG)1Ofx耐藥43WT4WT38D94G(GAC→GGC)15bR534R(CGG→CGT)1D94A(GAC→GCC)4T539N(ACC→AAC)1D94N(GAC→AAC)5E540D(GAA→GAC)1D94Y(GAC→TAC)3A543V(GCG→GTG)1A90V(GCG→GTG)10G551R(GGG→AGG)1S91P(TCG→CCG)5D94(GAC→TGC)1Mfx 0.5敏感35WT30WT32A90V(GCG→GTG)5cG551R(GGG→AGG)2aA100T(GCC→ACC)1T539N(ACC→AAC)1P5195(CCG→TCG)1Mfx 0.5耐藥43WT5WT38D94G(GAC→GGC)15dR534R(CGG→CGT)1D94A(GAC→GCC)4T539N(ACC→AAC)1藥物敏感性類型ngyrA基因突變類型菌株數(shù)gyrB基因突變類型菌株數(shù)D94N(GAC→AAC)4E540D(GAA→GAC)1D94Y(GAC→TAC)3A543V(GCG→GTG)1A90V(GCG→GTG)10G551R(GGG→AGG)1S91P(TCG→CCG)5D94(GAC→TGC)2Mfx 2.0敏感53WT35WT48A90V(GCG→GTG)10eT539N(ACC→AAC)2aD94G(GAC→GGC)2G551R(GGG→AGG)2D94A(GAC→GCC)2E540D(GAA→GAC)1D94N(GAC→AAC)2P5195(CCG→TCG)1D94Y(GAC→TAC)3S91P(TCG→CCG)3A100T(GCC→ACC)1Mfx 2.0耐藥25D94G(GAC→GGC)13aWT22D94A(GAC→GCC)2R534R(CGG→CGT)1D94N(GAC→AAC)3A543V(GCG→GTG)1A90V(GCG→GTG)4G551R(GGG→AGG)1S91P(TCG→CCG)2D94(GAC→TGC)2

注：WT(wild type)指菌株的相關(guān)基因片段測序未發(fā)生突變。a：有1株為雙突變；b：有5株為雙突變；c：有2株為雙突變；d：有4株為雙突變；e：有3株為雙突變。

2.3應(yīng)用耐藥基因判斷MDRMTB對FQs藥物耐藥的敏感性和特異性結(jié)果見表3。檢測gyrA基因突變判斷MDR MTB對FQs藥物耐藥的特異性高于gyrB基因突變(χ2=17.86、15.44、13.92，P<0.001)；檢測gyrA基因突變判斷MDR MTB對Ofx耐藥的敏感性高于gyrB基因突變(χ2=4.53，P<0.05)。

表3應(yīng)用gyrA與gyrB基因突變判斷MDRMTB對FQs藥物耐藥的敏感性和特異性

Tab.3SensitivityandspecificityofjudgingFQsdrugresistanceinMDRMTBbygyrAandgyrBgenemutations

基因型Ofx耐藥敏感性/%特異性/%Mfx 0.5耐藥敏感性/%特異性/%Mfx 2.0耐藥敏感性/%特異性/%gyrA基因90.788.688.485.758.1100.0gyrB基因62.545.762.545.737.568.6χ24.5317.863.4115.441.1613.92P<0.05<0.001>0.05<0.001>0.05<0.001

注：以藥物敏感性試驗結(jié)果為金標準。

3 討論

目前，與MTB對FQs藥物耐藥相關(guān)的基因中，研究最廣泛的是gyrA基因和gyrB基因突變。王志銳等[6]研究證明，gyrA基因QRDR發(fā)生突變是MTB對FQs藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因。但國內(nèi)有關(guān)MDR MTB對FQs藥物耐藥基因的相關(guān)研究較少，本研究主要就MDR MTB對FQs藥物耐藥的相關(guān)基因和突變位點進行分析，以尋找最能體現(xiàn)MDR MTB對FQs藥物耐藥的基因突變。本研究結(jié)果顯示，在90.7%的對Ofx耐藥MDR MTB中發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變；在88.4%的低濃度Mfx(0.5 mg·L-1)耐藥MDR MTB中發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變；在100%的高濃度Mfx(2.0 mg·L-1)耐藥MDR MTB中發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變；以上結(jié)果說明gyrA基因突變是MDR MTB對FQs藥物耐藥的主要原因。本研究中MDR MTB與FQs藥物耐藥相關(guān)的gyrA基因突變分布于90、91、94位點，其中g(shù)yrA基因于94位點出現(xiàn)突變的頻率最高，且在gyrA基因94位點出現(xiàn)突變的所有MDR MTB均對Ofx和低濃度Mfx耐藥，并對大部分高濃度Mfx耐藥，不僅說明MDR MTB對FQs藥物存在交叉耐藥性，還提示gyrA基因94位點突變可能是判斷MDR MTB 對FQs藥物耐藥的一個敏感指標。故在確定MDR肺結(jié)核患者抗結(jié)核治療方案時，若分子基因檢測證實gyrA基因94位點突變，不應(yīng)再選擇FQs藥物，或至少不能將其做為抗結(jié)核治療方案中的核心藥物之一。

本研究結(jié)果顯示，在gyrA基因突變并對Mfx耐藥的MDR MTB中還發(fā)現(xiàn)5株雙突變菌株，包括2株A90V+S91P、1株A90V+D94N、1株A90V+D94Y、1株D94N+D94Y。這5株雙突變菌株中僅1株對高濃度Mfx耐藥，其余4株均對低濃度Mfx耐藥，與以往劉志廣等[7]的研究結(jié)論“gyrA基因的雙突變與MTB對高濃度FQs藥物耐藥有關(guān)”不同。其原因可能為所觀察的菌株不同，劉志廣等[7]研究的菌株為MTB，而本研究的菌株為MDR MTB；gyrA基因的雙突變株在樣本中比例較少，故本研究認為，雙突變菌株對高濃度或低濃度FQs藥物耐藥的關(guān)系較難判斷。

本研究中，gyrB基因突變分布于534、539、540、543、551位點，在對FQs藥物耐藥菌株中g(shù)yrB基因突變發(fā)生率為11.6%～12.0%。有研究證實，gyrB基因在540位點的突變與FQs藥物耐藥密切相關(guān)[8]，但本研究發(fā)現(xiàn)，gyrB基因5個位點的突變分布均勻，并未發(fā)現(xiàn)540位點突變頻率高于其他位點。在本研究中，gyrB基因突變常與gyrA基因突變共同存在，gyrB基因的突變率遠低于gyrA基因，故認為gyrB基因突變并不是判斷MDR MTB對FQs藥物耐藥的敏感性和特異性指標。

FQs藥物是治療結(jié)核病重要的二線藥物，但FQs藥物的臨床應(yīng)用已二十余年，且被廣泛應(yīng)用于其他細菌感染的治療，致使該類藥物的耐藥率不斷上升。本研究發(fā)現(xiàn)，78株MDR MTB臨床分離株，對Ofx的耐藥率為55.1%，對Mfx 0.5的耐藥率為55.1%，對Mfx 2.0的耐藥率為32.1%，明顯高于非MDR MTB臨床分離株。

綜上所述，鄭州地區(qū)MDR MTB對FQs藥物耐藥率較高，耐藥的主要原因是gyrA基因突變，最常見的gyrA基因突變位于94位點。gyrB基因突變率明顯低于gyrA基因。故對MDR MTB患者來說，在應(yīng)用分子基因檢測技術(shù)檢測MDR MTB對FQs藥物的耐藥性時，應(yīng)重點檢測gyrA基因突變。

本研究尚有一些不足之處，如樣本量較小，沒有進行FQs藥物最低抑菌濃度的測定，無法準確了解gyrA、gyrB基因不同位點突變與最低抑菌濃度的相關(guān)性，還需今后的進一步研究。