李 悅，賀志安，任方龍，馬淑君，任明芬

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)雅仕杰醫(yī)學檢驗所質譜實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省免疫與靶向藥物重點實驗室，河南省分子診斷與醫(yī)學檢驗技術協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院內科，河南 新鄉(xiāng) 453002)

拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)是一種新型苯三嗪類抗癲癇藥，主要用于治療各種類型癲癇疾病，是兒童[1]和孕婦癲癇患者的首選藥物，也可用于治療各種類型情感障礙和抑郁癥等。LTG通過抑制興奮性神經遞質谷氨酸和天門冬氨酸的釋放，阻斷突觸前膜電壓依賴性鈉離子通道，抑制動作電位爆發(fā)，保證神經元的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抗癲癇作用。由于LTG藥物動力學和藥效學個體差異較大，治療窗較窄，且癲癇患者復發(fā)率高，易受聯(lián)合用藥[2]、懷孕[3]、藥物代謝酶和轉運體基因多態(tài)性[4]等多種因素影響，故需要對LTG進行血藥濃度監(jiān)測，以達到個體化的用藥方案，確保不良反應與療效之間的平衡。高效液相色譜法(high performance liquid chromatographic method，HPLC)技術應用較廣泛，是監(jiān)測LTG濃度的有效手段。國內外建立的一些測定LTG的HPLC法[5-6]預處理多采用萃取、氮吹等，操作復雜繁瑣，分析時間長，可能影響臨床醫(yī)生的決策。本研究建立了簡單、快捷、實用的測定人血清中LTG濃度的HPLC法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器LTG標準品(上海遠慕生物科技有限公司，純度>98%)，苯代三聚氰胺標準品[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度>98%]，甲醇、乙腈(美國Fisher公司，色譜純)，乙酸鉛(天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純)，人血清(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院提供)。ES Industries Sonoma C18(2)色譜柱(北京東方朗銳科技有限公司，50.0 mm×2.1 mm，3 μm)。高效液相色譜儀(日本島津公司)，超純水機(美國Pall Corporation公司)，十萬分之一分析天平(日本島津公司)，高速離心機(德國Centrifuge Eppedorf公司)，OF1旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)，EP管(中國羅氏公司)。

1.2LTG溶液配制精密稱量LTG標準品粉末37.75 mg，置于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋定容得濃度為0.377 5 g·L-1的儲備液備用。

1.3內標溶液配制精密稱量216.09 mg苯代三聚氰胺標準品粉末，置于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋至100 mL，得到濃度為2.160 9 g·L-1的儲備液，從中取250 μL置于100 mL容量瓶，得濃度為 5.40 mg·L-1的工作液。

1.4LTG色譜條件色譜柱：ES Industries Sonoma C18(2)(50.0 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：A相為超純水，B相為純甲醇，體積分數(shù)20%甲醇洗脫，流速為0.6 mL·min-1，進樣量20 μL；柱溫 40 ℃；紫外檢測波長207 nm，分析時間6 min。

1.5樣本處理取150 μL樣本血清于1.5 mL EP管中，加入150 μL甲醇、150 μL苯代三聚氰胺、15 μL 0.40 g·mL-1的乙酸鉛水溶液，充分渦旋混勻1 min后室溫放置10 min，25 ℃ 12 000 r·min-1渦旋離心10 min，離心后取上清液300 μL置于已加入 300 μL 超純水的進樣瓶，混勻后吸樣20 μL進行HPLC定量分析。

1.6方法學驗證

1.6.1方法的選擇性依據(jù)《中國藥典》2015年版通則中“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”[7]對所建方法進行驗證。分別取6份未服用LTG的正常人血清考察選擇性，不加苯代三聚氰胺，用150 μL甲醇、150 μL乙腈和15 μL乙酸鉛沉淀蛋白，樣本處理方法同“1.5項”操作，處理完樣品按“1.4項”方法進行分析，以峰面積響應值衡量干擾組分。按照ISO151892012醫(yī)學實驗室-質量和能力認可準則的要求[8]對儀器進行校準，做好實驗室各個環(huán)節(jié)的質量控制，規(guī)范工作流程，保證結果及時可靠。

1.6.2標準曲線依據(jù)藥典要求[7]，將配制好的LTG儲備液加入空白血漿中，得到LTG 為1.18、2.36、4.72、9.44、18.88、37.75 mg·L-1的血清標準品，余下操作同“1.5項”方法，處理完樣品按“1.4項”方法進行分析?？疾炀€性關系共做6套標準曲線，評價儀器對LTG分析物的響應，通過已知濃度的分析物與儀器檢測真實值的比較建立標準曲線。

1.6.3準確度與精密度評價依據(jù)“標準曲線”自制LTG定量下限(1.18 mg·L-1)、低濃度(2.36 mg·L-1)、中濃度(18.88 mg·L-1)、高濃度(28.31 mg·L-1)質控樣品，每個濃度5份，分3批在不同工作日測定，按“1.5項”方法操作，處理完樣品按“1.4項”方法進行分析，計算批內、批間精密度與準確度。準確度是描述方法測定值與真實值的接近程度，準確度=(測定值/真實值)×100%，采用已知質控樣品評估批內和批間準確度。精密度通過相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)評價，批內、批間RSD不超過15%，定量下限RSD不超過20%[7]。

1.6.4殘留評價將接近定量上限濃度的高濃度樣品(LTG濃度28.31 mg·L-1)加入到空白血清中制備高濃度質控樣品，按“1.5項”方法處理，按“1.4項”方法進行分析，考察高濃度樣品在空白樣品中的殘留。

1.6.5樣本穩(wěn)定性評價將配制好的LTG儲備液加入到空白血清中，配成高濃度(28.31 mg·L-1)和低濃度(2.36 mg·L-1)血清質控樣品，模擬樣本血清，經“1.5項”方法處理后室溫放置24 h，進行HPLC分析，每個濃度5份，評價LTG經沉淀蛋白法處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性情況。將未經蛋白沉淀處理的高、低濃度質控樣品分別放置2～8 ℃冰箱存放1周后，按“1.5項”處理進行HPLC分析，每個濃度5份，評價樣品在2～8 ℃ 放置1周的穩(wěn)定性。

2 結果

2.1方法的選擇性結果見圖1。LTG、苯代三聚氰胺的保留時間分別為4.43、2.96 min，LTG、苯代三聚氰胺處均無干擾。

A：空白；B：LTG+苯代三聚氰胺。a：苯代三聚氰胺峰；b：LTG峰。

圖1LTG和內標苯代三聚氰胺的選擇性

Fig.1SelectivityofLTGandbenzoguanamine

2.2標準曲線結果見圖2。LTG在1.18～37.75 mg·L-1的濃度范圍內線性關系良好，標準曲線為Y=0.013 05X+0.032 38，r=0.999。

圖2HPLC法測定LTG濃度的標準曲線

Fig.2StandardcurveforthedeterminationofLTGconcentrationbyHPLC

2.3精密度與準確度評價結果見表1。LTG在定量下限(1.18 mg·L-1)、低濃度(2.36 mg·L-1)、中濃度(18.88 mg·L-1)、高濃度(28.31 mg·L-1)質控樣品批內及批間RSD均小于13.2%，樣本適應性好，符合要求。

2.4殘留評價結果各分析物在空白中的殘留與定量下限濃度峰面積比值均<20%，內標在空白中的殘留與定量下限濃度峰面積比值均<5%，因此該方法的殘留結果符合要求，不影響準確度、精密度及樣品結果的測定。

2.5樣本穩(wěn)定性評價結果見表2。處理過的血清質控樣品室溫放置24 h，樣品的準確度結果穩(wěn)定；未處理過的血清質控樣品在2～8 ℃存放1周，樣品的準確度結果穩(wěn)定。

表1HPLC法測定LTG的準確度與精密度

質控樣品濃度/(mg·L-1)n批內準確度/%第1批第2批第3批批內RSD/%第1批第2批第3批批間準確度/%批間RSD/%1.18584.07±2.77101.20±1.84114.75±1.293.301.821.1299.94±13.1313.132.36592.12±1.14100.08±0.82106.78±2.321.240.812.7199.66±6.376.3918.88599.57±0.9995.51±1.3996.02±0.821.001.460.8597.03±2.132.1928.31599.46±0.7097.91±1.29105.82±2.010.701.321.90101.06±3.783.74

表2HPLC法測定人血清中LTG的穩(wěn)定性

Tab.2StabilityofthedeterminationofLTGinhumanserumbyHPLC

質控樣品濃度/(mg·L-1)準確度/%24 h1周2.36105.0892.802.36103.8188.982.36104.2492.802.36105.0889.832.36104.2489.8330.20104.0793.0130.20105.3691.2930.20104.0195.8330.20102.8594.2130.20102.4594.30

3 討論

LTG主要用于治療癲癇及精神障礙類疾病，服用量過少達不到抗癲癇的效果，嚴重影響患者的生活質量，服用過量可引發(fā)各種不良反應。TERAO等[9]研究表明，LTG用藥最常見的不良反應是皮疹。有研究顯示，患有癲癇和情緒障礙的孕婦患者一線藥物是LTG，而且體內血藥濃度水平波動較大[3]，建議在孕前、孕中及分娩后對此藥進行常規(guī)血藥濃度監(jiān)測。為達到病情控制與藥物不良反應之間的平衡，一般建議臨床醫(yī)生使用神經精神藥理學與藥物精神病學協(xié)會專家組推薦治療濃度范圍(推薦濃度為3～14 mg·L-1，警戒濃度20 mg·L-1)[10]對癲癇患者進行劑量調整。但LTG的有效治療濃度范圍尚存在爭議，國內學者普遍認為，LTG抗癲癇的治療濃度范圍是1～8 mg·L-1[11-13]，血藥濃度大于 8 mg·L-1時不良反應發(fā)生率顯著增加[13]?？紤]到種族體質差異、個體差異性大，LTG受藥物聯(lián)合應用、基因多態(tài)性等因素影響較多，僅憑給藥劑量很難確定體內LTG的真實濃度，仍需要通過藥物濃度監(jiān)測尋找最佳治療濃度范圍，使治療方案更具個體化，因此需要建立簡便、快速的HPLC法運用于臨床服用LTG患者的藥物濃度監(jiān)測。

本研究建立HPLC法測定人血清LTG的血藥濃度，依據(jù)《中國藥典》2015年版四部中“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”[7]對該方法進行驗證。本實驗中流動相選擇純甲醇和超純水，體積分數(shù)20% B相等度洗脫，有助于延長色譜柱壽命，簡化配比。采用苯代三聚氰胺作為內標，與LTG結構相似，保留時間適中，與樣品峰無干擾，且性質穩(wěn)定，物美價廉，可以滿足內標的要求。以往測定方法的預處理大多采用甲醇沉淀蛋白法，而本研究采用甲醇和乙酸鉛沉淀蛋白法測定LTG的濃度效果較好，離心后提取上清液即可上機處理，樣品干凈，檢測結果準確。此方法操作簡單、快速，采用ES Industries Sonoma C18(2)色譜柱能有效縮短分析時間，僅需 6 min 即可在液相色譜儀上完成1個標本的檢測，且分離度較好，峰形較好，可以實現(xiàn)高通量樣本的快速測定。經反復實驗比較發(fā)現(xiàn)，LTG和內標在 207 nm 紫外吸收波長下響應最強，無內源性干擾。方法學驗證結果顯示，本方法的選擇性較好，不受其他內源性物質的干擾，空白基質干擾小，殘留結果符合要求；LTG在1.18～37.75 mg·L-1范圍內線性關系良好(r=0.999)，在定量下限、低、中、高濃度批內與批間RSD均小于13.2%，樣本適應性好，不同儲存條件下LTG結果穩(wěn)定，這與其理化性質穩(wěn)定有關，能確保測定結果反映患者采樣時的分析物濃度，可以滿足所有臨床樣本的檢測需求。本方法僅需150 μL血清樣本，可實現(xiàn)小樣本準確測定藥物水平，適合臨床常規(guī)LTG藥物濃度監(jiān)測，有利于基層醫(yī)院送檢樣本的集中處理。

綜上所述，本研究建立了分析速度快、操作簡便、選擇性好、準確度高、符合生物樣品分析要求的測定LTG臨床血藥濃度的HPLC分析方法，有助于達到臨床精準治療。