夏天光，孔憲斌，王明麗，畢 瑩，呂方方，梁 軍，姜 偉，孫 倩，董化江，李曉紅

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津 300162；2.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院心臟科，天津 300162；3.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)的致死率和致殘率高，是一類嚴重危害人們健康的疾病[1-2]。海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)顆粒下區(qū)(subgranular zone，SGZ)的成體神經(jīng)發(fā)生對TBI后認知功能的恢復(fù)具有潛在的重要作用。有研究顯示，TBI可誘導(dǎo)海馬DG SGZ的神經(jīng)發(fā)生[3-4]，但新生的成體神經(jīng)干細胞(neural stem cell，NSC)只有小部分能夠存活并分化成熟。TBI后缺氧和毒素累積的微環(huán)境進一步導(dǎo)致新生細胞的低存活率和低成熟率[5]。由此可見，如何提高TBI后新生神經(jīng)元的存活和誘導(dǎo)其分化成熟是成體NSC修復(fù)TBI神經(jīng)功能需要著重解決的問題。以膜去極化為代表的電興奮性對新生神經(jīng)元的成熟至關(guān)重要，并在胚胎和成體早期神經(jīng)元發(fā)育過程中促進功能性突觸的形成[6]。光遺傳學(xué)方法中藍光可激活視紫紅質(zhì)通道蛋白-2(channelrhodopsin-2，ChR2)，使膜去極化并觸發(fā)動作電位。特定啟動子下的ChR2工程細胞為膜去極化和神經(jīng)元興奮的研究提供了一種新的且強有力的工具。有研究在新生細胞中使用Nestin或天冬氨酸轉(zhuǎn)運體(gamma-ray large area space telescope，GLAST)作為啟動子，但被Nestin或GLAST標(biāo)記的細胞仍是多能且具備有絲分裂能力，這不適合研究新生神經(jīng)元存活和成熟。研究證實，海馬DG區(qū)NSC的存活和成熟呈現(xiàn)出2個關(guān)鍵時期，一是 2b型中間祖細胞至3型中間祖細胞的過渡期間；二是非成熟神經(jīng)元至成熟神經(jīng)元的過渡期間[7]。這2個關(guān)鍵時期的神經(jīng)元均表達DCX蛋白。因此，DCX陽性且表達ChR2的新生細胞是光遺傳學(xué)調(diào)控去極化的理想靶細胞。因此，本研究使用光遺傳工具激活TBI后DG區(qū)表達DCX的新生神經(jīng)元，在成體神經(jīng)發(fā)生階段，光調(diào)控表達DCX神經(jīng)元的去極化，以探討光調(diào)控去極化對TBI小鼠海馬DG新生神經(jīng)元的存活、成熟及對TBI小鼠認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康無特定病原(specific pathogen-free，SPF)級8周齡雄性C57BL/6小鼠66只，體質(zhì)量 22～24 g，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，動物許可證號：SCXK(京)2016-0011。

1.2試劑與儀器NeuN、BrdU抗體均購自英國Abcam公司，BrdU購自美國Sigma公司，熒光二抗Alexa Fluor 405、488和610均購自澳大利亞Invitrogen公司，慢病毒ChR2-DCX-EGFP由上海和元生物技術(shù)股份有限公司構(gòu)建，病毒滴度為3×1011L-1；液壓沖擊損傷儀購自美國Custom Design and Fabrication公司。人工腦脊液(0.119 0 mol·L-1氯化鈉，0.002 3 mol·L-1氯化鉀，0.001 3 mol·L-1硫酸鎂，0.002 5 mol·L-1氯化鈣，0.026 2 mol·L-1碳酸氫鈉，0.001 0 mol·L-1磷酸二氫鈉和0.011 0 mol·L-1葡萄糖)為人工配制。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組及TBI模型制備小鼠隨機分為假手術(shù)組(n=10)、TBI組(n=12)、TBI+增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)組(n=12)和TBI+ChR2組(n=32)。假手術(shù)組小鼠行單純開顱手術(shù)，未行液壓沖擊；TBI組小鼠給予液壓沖擊制備TBI模型；TBI+EGFP組小鼠給予液壓沖擊制備TBI模型后感染慢病毒DCX-EGFP；TBI+ChR2組小鼠給予液壓沖擊制備TBI模型后感染慢病毒DCX-ChR2-EGFP。各組小鼠均于造模后連續(xù)7 d行腹腔內(nèi)注射BrdU(100 mg·kg-1)。具體造模方法為：小鼠按50 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射戊巴比妥進行麻醉，選擇前囟后4.0 mm、中線旁開2.2 mm，在右頂顱骨開3.5 mm骨窗，保證硬膜完好無破損，然后將損傷連接管置于暴露的硬腦膜上，用玻璃離子體水門汀黏合，通過改造的連接適配器連接到液壓沖擊損傷裝置上，使用壓力脈沖(2.4 atm)快速沖擊閉合的顱腔。手術(shù)過程中使直腸溫度保持在37 ℃。

1.3.2免疫熒光染色檢測TBI組小鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元存活和成熟情況在造模后7、28 d分別處死3只小鼠，取腦組織置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h，采用振蕩切片機連續(xù)切片制備腦組織切片，厚20 μm。將TBI組腦切片置于含體積分數(shù)0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中透化處理20 min，0.01 mol·L-1PBS緩沖液洗片3次，每次5 min。然后將切片浸入體積分數(shù)0.5%H2O2甲醇溶液中孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，然后用50 g·L-1牛血清白蛋白在室溫下封閉非特異性結(jié)合位點30 min。加入一抗BrdU于4 ℃下過夜，次日加入一抗NeuN于4 ℃下過夜。然后用波長為 610、405、488 nm的熒光二抗孵育60 min。4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(diamidine phenylindole，DAPI)染色10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，最后使用共聚焦顯微鏡觀察新生神經(jīng)元存活和成熟情況。每個時間點隨機選取大鼠海馬DG區(qū)各3張切片，每張切片計數(shù)5個視野并拍照。

1.3.3倒置熒光顯微鏡觀察假手術(shù)組和TBI+ChR2組海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元變化造模前2 d，將DCX-ChR2-EGFP慢病毒注射到TBI+ChR2組小鼠的DG區(qū)。造模后立即將光纖植入海馬DG區(qū)，造模后3～28 d進行在體光刺激。假手術(shù)組和TBI+ChR2組小鼠在造模后不同時間點(3、5、7、9、12、18、28 d)行40 g·L-1多聚甲醛心臟灌注，每個時間點處死3只小鼠，取腦組織采用震蕩切片機連續(xù)切片制備腦組織切片，厚20 μm。對切片進行細胞核DAPI避光染色10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元的變化，DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元定量計數(shù)方法同“1.3.2項”。

1.3.4Morris水迷宮實驗檢測各組小鼠認知功能麻醉各組小鼠，將光纖植入損傷側(cè)的DG區(qū)，造模后3～12 d進行在體光刺激。造模后21～26 d行Morris 水迷宮實驗，訓(xùn)練4組小鼠尋找水下隱匿平臺，在水池中加入牛奶使水變得不透明，水溫保持在約26 ℃。每次訓(xùn)練重復(fù)3次(間隔15 s)，記錄大鼠尋找隱匿平臺的潛伏期。造模后26 d進行平臺測試，28 d撤去平臺，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限停留的時間。

1.3.5免疫熒光染色檢測小鼠海馬DG區(qū)表達DCX神經(jīng)元的存活和成熟情況造模后28 d，采用免疫熒光染色檢測TBI組、TBI+EGFP組和TBI+ChR2組小鼠同側(cè)海馬顆粒細胞層NeuN和BruU雙標(biāo)記的新生成熟神經(jīng)元，免疫熒光染色步驟同“1.3.2項”。

2 結(jié)果

2.1TBI組小鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元存活及成熟情況結(jié)果見圖1。造模后7、28 d，TBI組小鼠海馬DG區(qū)新生成熟神經(jīng)元數(shù)量分別為(2 100.0±236.9)、(584.3±69.2)個·mm-3；造模后28 d新生成熟神經(jīng)元數(shù)量顯著少于造模后7 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。造模后7～28 d，約78%的新生神經(jīng)元消失。

A、C：×200；B、D：A、C中1、2的放大圖(×400)。

圖1造模后7d和28dTBI組小鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元存活和成熟情況(免疫熒光染色)

Fig.1SurvivalandmaturationofnewbornneuronsinDGareaofhippocampusat7daysand28daysaftermodeling(immunofluorescencestaining)

2.2假手術(shù)組和不同時間點TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元變化情況結(jié)果見圖2和表1。從造模后3 d起，TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量開始上升，9 d達到高峰，12 d開始明顯下降。造模后3、18、28 d，TBI+ChR2組與假手術(shù)組小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；造模后5、7、9、12 d TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。造模后9 d，TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量均顯著高于其他各時間點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

A：假手術(shù)組；B：TBI+ChR2組造模后3 d；C：TBI+ChR2組造模后9 d；D：TBI+ChR2組造模后28 d。

圖2假手術(shù)組和TBI+ChR2組不同時間點海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元表達情況(DAPI染色，×200)

Fig.2ExpressionofDCX-EGFPpositivenewbornneuronsinhippocampalDGregionofmiceinshamoperationgroupandTBI+ChR2groupatdifferenttimepoints(DAPIstaining，×200)

表1假手術(shù)組和TBI+ChR2組不同時間點小鼠海馬DG區(qū)DCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量比較

組別nDCX-EGFP陽性新生神經(jīng)元數(shù)量/(個·mm-3)假手術(shù)組31 032.0±89.9TBI+ChR2組 造模后3 d31 129.0±98.5 造模后5 d31 875.0±178.3a 造模后7 d32 356.9±247.8b 造模后9 d33 542.7±365.3bc 造模后12 d32 475.6±233.9b 造模后18 d31 578.6±147.2c 造模后28 d31 295.6±128.4c

注：與假手術(shù)組比較aP<0.05，bP<0.01；與造模后3、5、7、12、18、28 d 比較cP<0.05。

2.3光調(diào)控表達DCX的細胞去極化對TBI小鼠認知功能的影響結(jié)果見表2和表3。造模后 21 d，4組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后22～26 d，TBI組和TBI+EGFP組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期均顯著長于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TBI+ChR2組與假手術(shù)組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TBI+EGFP組與TBI組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；TBI+ChR2組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期均顯著短于TBI組和TBI+EGFP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。TBI組和 TBI+EGFP組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)均顯著少于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TBI+ChR2組與假手術(shù)組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TBI+ChR2組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)均高于TBI組和TBI+EGFP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TBI+EGFP組與TBI組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2各組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期

組別n尋找隱匿平臺的潛伏期/s21 d22 d23 d24 d25 d26 d假手術(shù)組1059.5±1.138.2±4.223.6±2.418.9±2.211.0±1.56.5±0.8TBI組959.8±1.751.0±7.0a38.8±5.4a36.6±5.8a30.7±4.9a24.7±3.9aTBI+EGFP組1259.6±1.052.4±5.7a39.7±3.5a36.9±4.1a28.9±3.9a22.4±3.2aTBI+ChR2組1459.5±1.543.7±6.3bc29.9±3.7bc25.4±4.9bc15.6±3.9bc10.4±2.5bc

注：與假手術(shù)比較aP<0.01；與TBI組比較bP<0.01；與TBI+EGFP組比較cP<0.01。

表3各組小鼠在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)

組別n目標(biāo)象限停留時間/s穿越平臺次數(shù)假手術(shù)組1042.4±6.05.9±0.7TBI組919.4±3.7a1.9±0.3aTBI+EGFP組1220.9±3.9a2.1±0.4aTBI+ChR2組1434.7±4.2bc4.4±0.6bc

注：與假手術(shù)比較aP<0.01；與TBI組比較bP<0.01；與TBI+EGFP組比較cP<0.05。

2.4小鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元存活及成熟情況結(jié)果見圖3。造模后28 d，TBI組、TBI+EGFP組和TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)新生成熟神經(jīng)元數(shù)量分別為(723.4±82.3)、(783.0±89.6)、(3 201.5±365.1)個·mm-3；TBI+ChR2組小鼠海馬DG區(qū)新生成熟神經(jīng)元數(shù)量明顯高于TBI組和TBI+EGFP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；TBI組與TBI+EGFP組小鼠海馬DG區(qū)新生成熟神經(jīng)元數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

A：TBI組；B：TBI+EGFP組；C：TBI+ChR2組。

圖3小鼠海馬DG區(qū)新生神經(jīng)元存活及成熟情況(免疫熒光雙標(biāo)染色，×400)

Fig.3SurvivalandmaturityofneonatalneuronsinhippocampalDGregionofmiceineachgroup(immunofluorescentdoublelabelledstaining，×400)

3 討論

TBI可導(dǎo)致成體NSC大量增殖。然而，新生的成體NSC只有小部分能夠存活和分化成熟，最終整合入神經(jīng)環(huán)路。引起新生成體NSC死亡的因素有很多，其分化成熟的能力低下是最主要的原因之一。為解決TBI后新生細胞低存活和低成熟率的問題，本研究選擇光遺傳學(xué)方法通過膜去極化電激活這些細胞。為了獲得ChR2-EGFP特異性靶向表達DCX蛋白的新生細胞，將慢病毒ChR2-DCX-EGFP立體定向注射感染小鼠海馬DG區(qū)神經(jīng)干細胞，觀察到藍光激活可有效引起表達DCX蛋白的細胞發(fā)生膜去極化，并且顯著促進新生細胞的存活和成熟。

TBI可誘導(dǎo)海馬DG區(qū)NSC增殖并分化為神經(jīng)元[8]。促進這種新生神經(jīng)元的生成可修復(fù)TBI后神經(jīng)功能[9]。本研究結(jié)果顯示，TBI后7、28 d DG區(qū)有大量新生細胞在初始階段分化為神經(jīng)元，但最終只有少數(shù)細胞存活并成熟，表明海馬DG區(qū)成體神經(jīng)發(fā)生過程中新生神經(jīng)元若不能遷移和成熟將最終走向死亡。

電活動在成體神經(jīng)發(fā)生的各個階段均起著關(guān)鍵作用，尤其是在神經(jīng)分化階段[10]。有研究顯示，有絲分裂的神經(jīng)元細胞膜去極化可影響神經(jīng)元的存活、成熟及功能整合[11]，然而，傳統(tǒng)的電生理調(diào)控技術(shù)難以精確調(diào)控某一類靶細胞。光遺傳學(xué)已被用于研究復(fù)雜神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能[12-13]，其可精確的從空間和時間調(diào)控成體新生神經(jīng)元的活動[14-15]。大多數(shù)研究利用光遺傳學(xué)來調(diào)控一組細胞或是研究某個神經(jīng)回路，對于光門控陽離子ChR2介導(dǎo)的去極化作用卻很少涉及。光遺傳學(xué)調(diào)控神經(jīng)元功能具有時空精度高的特點，相對于其他傳統(tǒng)的電生理技術(shù)具有很大的優(yōu)勢，因此，本研究選擇光遺傳學(xué)作為調(diào)控細胞去極化工具。ChR2是研究神經(jīng)元活動變化的一種強有效工具[16]。在特定的啟動子下，EGFP-ChR2基因可被插入到要調(diào)控的細胞中。DCX基因編碼一種相對分子質(zhì)量40 000的微管相關(guān)蛋白。新生神經(jīng)元中DCX的缺失會導(dǎo)致嚴重的形態(tài)缺陷和遷移延遲。在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，DCX主要存在于成體海馬DG區(qū)和側(cè)腦室室管膜下區(qū)[17-18]。在成體神經(jīng)發(fā)生過程中，DCX在增殖的神經(jīng)祖細胞和有絲分裂后的神經(jīng)元前體細胞中瞬時表達。DCX這種特異性表達模式提示可將其作為啟動子標(biāo)記新生神經(jīng)元。本研究觀察到，不僅是未成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)母細胞表達DCX蛋白，2b型中間祖細胞也有DCX蛋白表達，提示表達DCX的新生細胞存在一個供調(diào)控電活動的長時程窗口。本研究定量結(jié)果顯示，在TBI后3 d，表達DCX的細胞數(shù)量開始上升，9 d達到高峰，12 d開始下降，表明損傷后3～12 d 是光調(diào)控神經(jīng)細胞去極化的最佳時間窗。本研究選擇DCX作為啟動子驅(qū)動新生細胞中ChR2-EGFP的表達，是因為在各種刺激條件下DCX可以保持相對穩(wěn)定，并且其能長期表達，覆蓋細胞存活和成熟的關(guān)鍵期[19]。通過Morris水迷宮實驗檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光調(diào)控表達DCX細胞的去極化，可以改善TBI所致的認知缺陷。本研究還發(fā)現(xiàn)，通過免疫熒光共定位染色BrdU(標(biāo)記新生細胞)和NeuN(標(biāo)記成熟神經(jīng)元)證實，TBI后長時間內(nèi)光調(diào)控表達DCX細胞的去極化可促進其存活和成熟。

綜上所述，本研究采用ChR2介導(dǎo)的去極化這種新方法來激活TBI后的新生細胞使其趨于成熟。重點關(guān)注新生細胞成熟過程中2b型中間神細胞至3型中間祖細胞的過渡期和非成熟神經(jīng)元至成熟神經(jīng)元的過渡期這2個關(guān)鍵時期，并選擇DCX驅(qū)動新生細胞中ChR2-EGFP的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達DCX的新生細胞覆蓋了這2個關(guān)鍵時期，這就為研究ChR2介導(dǎo)的光調(diào)控新生神經(jīng)元去極化提供了一個長期而穩(wěn)定的時間窗。DCX作為一可靠的啟動子，可在時間和空間上精確觸發(fā)新生神經(jīng)元去極化，最終促進TBI后新生神經(jīng)元的存活和成熟，且TBI+ChR2組小鼠尋找隱匿平臺的潛伏期顯著縮短，在目標(biāo)象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著提高，提示光調(diào)控新生細胞去極化可顯著改善TBI小鼠認知功能缺陷。