謝 冬，翟成凱，劉影影，趙 樂(lè)，張彬彬，吳衛(wèi)東

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院呼吸科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

支氣管上皮細(xì)胞是呼吸道黏膜的第1道屏障，在抵御病原體、異物入侵和機(jī)械損傷的過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用[1]。支氣管上皮細(xì)胞與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，通過(guò)損傷后的異常修復(fù)，分泌多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，參與疾病發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)[2]。目前，用于實(shí)驗(yàn)研究的離體支氣管上皮細(xì)胞主要有原代支氣管上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞株[3-5]。細(xì)胞株來(lái)源單一，喪失了原有組織細(xì)胞的某些功能特性，對(duì)于評(píng)價(jià)正常細(xì)胞的行為具有局制性[6]。人支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)亦有報(bào)道，主要是通過(guò)外科手術(shù)切除[7]和機(jī)械刷洗法[8]獲取細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶消化法[8]、組織貼塊法[7]分散為單個(gè)細(xì)胞，可用于體外研究，但步驟繁瑣，差異化較大，細(xì)胞存活率有待提高[9]。基于此，本研究通過(guò)纖維支氣管鏡刷檢獲取支氣管上皮細(xì)胞，探索一種實(shí)驗(yàn)環(huán)境更貼合人體、方便快捷、細(xì)胞活性和純度較高的支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，并進(jìn)行鑒定，為支氣管上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1原代支氣管上皮細(xì)胞來(lái)源原代支氣管上皮細(xì)胞取自新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院支氣管鏡室行支氣管鏡檢查者63例，男39例，女24例，年齡35～76(55.5±3.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：支氣管壁正常者。排除標(biāo)準(zhǔn)：支氣管壁損傷、感染及咯血患者。被檢查者及其家屬知情同意，簽署知情同意書，且本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器鼠尾膠原蛋白I型、RPMI 1640培養(yǎng)基、支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)基(bronchical epithelial cell growth medium，BEGM)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胰蛋白酶-乙二酸四乙酸消化液、牛血清(美國(guó)索萊寶公司)，兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體(美國(guó)Origene公司)，山羊抗兔二抗辣根過(guò)氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)/標(biāo)記的兔免疫球蛋白(immunoglobulin，IgG)聚合物(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，吐溫20(廣州威佳科技有限公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(美國(guó)MP公司)；一次性支氣管刷(江蘇省海門市揚(yáng)子醫(yī)療器械有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)，離心管(美國(guó)Corning公司)，一次性吸液管(美國(guó)Nest公司)，AE2000倒置生物式顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)，JW-1042R低速冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被用0.006 mol·L-1的無(wú)菌乙酸將膠原蛋白稀釋至0.03 g·L-1，在12孔板內(nèi)每孔加300 μL，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面，開蓋在超凈臺(tái)常溫放置1 h后，PBS洗3次，超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)吹干并紫外消毒30 min后使用。

1.4支氣管上皮細(xì)胞獲取及培養(yǎng)被檢查者取仰臥位，通過(guò)纖維支氣管鏡用生理鹽水沖洗支氣管前壁，靜臥10 min后，經(jīng)支氣管鏡用一次性支氣管刷取支氣管前壁上皮細(xì)胞，用無(wú)菌剪刀剪下前端毛刷，放入裝有RPMI 1640培養(yǎng)基的離心管內(nèi)(無(wú)菌操作)，30 min內(nèi)冰盒運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，用培養(yǎng)液沖洗毛刷數(shù)次后，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入150 μL BEGM，用一次性吸液管反復(fù)吹打均勻，吸取30 μL滴入培養(yǎng)皿中央，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入500 μL BEGM，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液1次，至細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。

1.5支氣管上皮細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)將胰蛋白酶-乙二酸四乙酸消化液加入培養(yǎng)皿消化 5 min，加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，1 500 r·min-1離心 5 min，棄上清液，加入1 mL BEGM，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入4 mL BEGM，轉(zhuǎn)移至底面積為25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d 換液1次，至細(xì)胞鋪滿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入胰蛋白酶-乙二酸四乙酸消化液，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min，加入BEGM終止消化，一次性吸液管反復(fù)吹打混合均勻，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，小心緩慢地吸去上清液，加入 2 mL BEGM混合均勻，用移液槍吸取 10 μL 細(xì)胞懸液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，倒置生物式顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板上4個(gè)象限細(xì)胞數(shù)，取均值，估算細(xì)胞密度，液氮中冷存。

1.6支氣管上皮細(xì)胞的鑒定

1.6.1形態(tài)學(xué)觀察在刷檢獲得的支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的第1、3、11、16、17、18天，分別于倒置生物式顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6.2人支氣管上皮細(xì)胞存活率擴(kuò)大培養(yǎng)的人原代支氣管上皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%以后，加入胰蛋白酶-乙二酸四乙酸消化液消化，放入恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中，將貼壁的支氣管上皮細(xì)胞于20 ℃消化5 min，加入4 mL BEGM終止消化，反復(fù)吹打混合均勻，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心5 min。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒離心管外壁，置于紫外線消毒過(guò)的超凈工作臺(tái)中，小心緩慢吸去上清液，加入2 mL BEGM混合均勻，然后取18 μL細(xì)胞懸液與2 μL體積分?jǐn)?shù)0.4%錐蟲藍(lán)染液混合均勻后，取混合液10 μL滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于倒置生物式顯微鏡下進(jìn)行觀察，死細(xì)胞可以被錐蟲藍(lán)染成藍(lán)色，活細(xì)胞則為無(wú)色透明，在3 min內(nèi)分別計(jì)數(shù)4個(gè)視野中死細(xì)胞與活細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算人支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞存活率。隨機(jī)選取3個(gè)樣本進(jìn)行存活率測(cè)定，取均值。

1.6.3人支氣管上皮細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)的人原代支氣管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁的80%～90%時(shí)，加入胰蛋白酶-乙二酸四乙酸消化液，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min，加入4 mL BEGM終止消化，反復(fù)吹打混合均勻，收集細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，小心緩慢地吸去上清液，加入2 mL BEGM混合均勻，取10 μL細(xì)胞懸液滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，倒置生物式顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板上4個(gè)象限細(xì)胞數(shù)，取均值。根據(jù)爬片所需的細(xì)胞濃度和體積計(jì)算制作細(xì)胞爬片所需培養(yǎng)基的量，將剩余的細(xì)胞混合液 1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，在剩下的沉淀中加入計(jì)算好的培養(yǎng)基混合均勻，取 5×104個(gè)細(xì)胞接種于清洗好的玻片上進(jìn)行培養(yǎng)，每1～2 d換液1次，倒置生物式顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，爬片制作完成；然后，用一次性滅菌槍頭吸出放置爬片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入PBS 500 μL，靜置4 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 500 μL，靜置 4 min，重復(fù)上述步驟3次；多聚甲醛固定細(xì)胞爬片15～20 min后，吸出多聚甲醛，加入PBS 1 mL，靜置5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次；吸取通透液950 μL和牛血清50 μL，配制成體積分?jǐn)?shù)5%的牛血清溶液，加至放置爬片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中固定30～60 min；吸出培養(yǎng)皿中的牛血清溶液，然后每孔加PBS 1 mL，靜置5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次；然后進(jìn)行一抗孵育：細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入兔抗人細(xì)胞角蛋白8單克隆抗體30 μL進(jìn)行標(biāo)記，抗體稀釋濃度為11 000，將爬片細(xì)胞面朝下貼合一抗，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；第2天早上進(jìn)行二抗孵育，放置爬片的細(xì)胞皿中加PBS 1 mL，靜置5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次，然后在爬片上細(xì)胞面滴加山羊抗兔二抗HRP/IgG聚合物，孵育箱中室溫孵育1 h；然后在放置爬片的細(xì)胞孔板加入PBS 1 mL，靜置5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次；將吐溫20用PBS配制成體積分?jǐn)?shù)0.3%的吐溫20溶液，向放置爬片的細(xì)胞孔板加入3 mL PBS及9 μL體積分?jǐn)?shù)0.3%的吐溫20，混合均勻，靜置5 min；然后向放置爬片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入PBS 1 mL，靜置 5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次；加細(xì)胞核熒光染料DAPI染色15 min，吸出，然后加入PBS 1 mL，靜置5 min，吸出原來(lái)的PBS，再加入新的PBS 1 mL，靜置5 min，重復(fù)上述步驟3次；然后用體積分?jǐn)?shù)90%甘油封片，置于倒置生物式顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞質(zhì)著色為綠色、細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色即為支氣管上皮細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察人支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第1天，鏡下可見纖毛擺動(dòng)，細(xì)胞桿狀透明，單個(gè)、散在分布(圖1A)；培養(yǎng)第3天，細(xì)胞逐漸貼壁、變大，呈多邊形，細(xì)胞聚集成團(tuán)，呈鋪路石樣(圖1B)；培養(yǎng)第11天，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，大小均勻一致，可見大片的扁平狀、多邊形細(xì)胞，密集呈鋪路石樣分布生長(zhǎng)，約占整個(gè)孔的80%～90%(圖1C)；培養(yǎng)第16天，細(xì)胞增多，鋪路石樣生長(zhǎng)，細(xì)胞團(tuán)變大(圖1D)；培養(yǎng)第17天，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，相鄰較小的細(xì)胞團(tuán)塊逐漸融合呈片狀(圖1E)；培養(yǎng)第18天，細(xì)胞增殖明顯，可見大片的扁平狀、多邊形細(xì)胞，細(xì)胞大小均勻一致，增殖成片狀，密集呈鋪路石樣分布生長(zhǎng)，約占瓶壁的70%～80%(圖1F)。

A：人支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第1天；B：支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第3天；C：支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第11天；D：支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第16天；E：支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第17天；F：支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)第18天。

圖1支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×100)

Fig.1Morphologicalfeaturesofbronchialepithelialcells(×100)

2.2支氣管上皮細(xì)胞的存活率支氣管上皮細(xì)胞平均存活率為(96.8±0.5)%。

2.3支氣管上皮細(xì)胞鑒定免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)著色為綠色(圖2A、圖2B)，細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色(圖2C、圖2D)，鑒定為人支氣管上皮細(xì)胞。

A：細(xì)胞質(zhì)著色為綠色(×100)；B：細(xì)胞質(zhì)著色為綠色(×400)；C：細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色(×100)；D：細(xì)胞核復(fù)染為藍(lán)色(×400)。

圖2支氣管上皮細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

Fig.2Immunohistochemicalstainingresultsofbronchialepithelialcells

3 討論

支氣管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)目前已經(jīng)由單層培養(yǎng)發(fā)展到三維立體培養(yǎng)，即氣液界面(air-liquid interface，ALI)培養(yǎng)，更真實(shí)地模擬體內(nèi)呼吸道，為進(jìn)行呼吸系統(tǒng)相關(guān)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究做準(zhǔn)備。雖然 ALI 培養(yǎng)的研究在國(guó)外已有 30 多年的歷史[10]，但全球只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室成功建立了該培養(yǎng)平臺(tái)，且不同實(shí)驗(yàn)室采用的方法各異，比如原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)、ALI培養(yǎng)基的添加成分、預(yù)鋪膠原的類型、細(xì)胞接種密度等各不相同[11]。本實(shí)驗(yàn)在原代細(xì)胞分離培養(yǎng)方面進(jìn)行改良，旨在探索ALI培養(yǎng)的更優(yōu)方法。

目前，實(shí)驗(yàn)研究中支氣管上皮細(xì)胞的來(lái)源主要有2種途徑：外科手術(shù)切除的支氣管組織和經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢[12-15]得到的支氣管上皮細(xì)胞。外科手術(shù)切除獲取支氣管組織，需除去結(jié)締組織以后用蛋白酶消化法分離以獲取單個(gè)的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，該方法流程繁瑣，獲取支氣管組織需震蕩消化12～24 h[12]，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在獲取支氣管上皮細(xì)胞之前需經(jīng)酶消化，破壞了細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白分子等成分及緊密連接結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生改變，不能很好地模擬體內(nèi)環(huán)境，可能不利于細(xì)胞的貼壁和增殖。而經(jīng)纖維支氣管鏡刷檢法，有文獻(xiàn)指出，單純機(jī)械刷洗獲取的主要是氣道上皮分泌物和衰老并容易脫落的纖毛細(xì)胞，其中混雜有大量紅細(xì)胞，收獲量不高[15]。本研究中，在行刷檢之前通過(guò)用生理鹽水沖洗支氣管前壁，并使被檢查者仰位靜臥10 min，盡量降低支氣管分泌物和衰老脫落細(xì)胞對(duì)刷檢結(jié)果的影響，以獲得較多的細(xì)胞活性較高的正常支氣管上皮細(xì)胞。

在細(xì)胞活性保持方面，經(jīng)外科手術(shù)切除獲取支氣管組織進(jìn)行原代培養(yǎng)的過(guò)程中，手術(shù)標(biāo)本開始分離、培養(yǎng)時(shí)往往離體時(shí)間已較長(zhǎng)，細(xì)胞活性大大降低[15]。本研究中，刷檢獲取支氣管上皮細(xì)胞以后，存放于RPMI 1640培養(yǎng)基，30 min內(nèi)冰盒運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，并直接接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行原代培養(yǎng)，最大程度保持了細(xì)胞的活性和結(jié)構(gòu)的完整性。刷檢獲取的支氣管上皮細(xì)胞，可能由于刷檢力度過(guò)大致黏膜出血，使獲取的上皮細(xì)胞中混雜有血細(xì)胞和上皮下的成纖維細(xì)胞。本研究則利用血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞不能在無(wú)血清的BEGM中生長(zhǎng)的特點(diǎn)，通過(guò)使用無(wú)血清BEGM達(dá)到分離、純化上皮細(xì)胞的目的，實(shí)驗(yàn)操作更加方便、簡(jiǎn)單，培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫組織化學(xué)染色鑒定為人支氣管上皮細(xì)胞，且平均細(xì)胞存活率為(96.8±0.5)%。

綜上所述，通過(guò)支氣管鏡刷檢獲取支氣管上皮細(xì)胞，可以在保證細(xì)胞活性的基礎(chǔ)上分離獲得較多單個(gè)支氣管上皮細(xì)胞，通過(guò)無(wú)血清BEGM去除混雜的血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，純化支氣管上皮細(xì)胞，是一種高效、方便、獲取細(xì)胞存活率較高的支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，有利于支氣管上皮細(xì)胞相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究。