郭東慧，毛中鵬，王東洋，于曉雙，鄭文博

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州市第三人民醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，河南 鄭州 450000；3.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科，天津 300162；4.禹州市中心醫(yī)院內(nèi)一科，河南 禹州 461670；5.解放軍31609部隊(duì)衛(wèi)生室，江蘇 南通 226000；6.信陽(yáng)市中心醫(yī)院急診科，河南 信陽(yáng) 464000)

射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)是局灶性肝癌最常用的治療方法，但其治療后的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)中、晚期肝癌殘余腫瘤的復(fù)發(fā)[1]和轉(zhuǎn)移[2-3]。巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)肝癌RFA術(shù)后的炎癥及纖維化中發(fā)揮重要作用，且與疾病進(jìn)展有關(guān)。血液中的單核細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同途徑極化為M1型或M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用，引起肝臟纖維化；M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用，促進(jìn)肝臟修復(fù)[3-4]。sCD163是M2型巨噬細(xì)胞活化后的標(biāo)志物，可作為肝癌患者總生存期不良預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)[5]。在腫瘤細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子或炎性因子的影響下，腫瘤組織中的M1(iNOS+)型巨噬細(xì)胞易極化為M2(CD206+)型[6-8]，腫瘤發(fā)生過(guò)程與上述機(jī)制密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞極化是單核細(xì)胞活化后一系列功能狀態(tài)的2個(gè)極端，但肝癌RFA術(shù)后對(duì)巨噬細(xì)胞M2型極化的調(diào)節(jié)作用仍不明確，M2型極化對(duì)肝癌RFA術(shù)后的預(yù)后也不清楚。本課題通過(guò)建立RFA肝損傷炎癥模型，研究RFA術(shù)后炎癥微環(huán)境對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響，為深入探討M2型巨噬細(xì)胞如何調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境來(lái)減少肝癌RFA術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠[SGWK-(軍)2014～2020]36只，5.5～6.0月齡，體質(zhì)量350～400 g，飼養(yǎng)于救援醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫控制在20～25 ℃，空氣流通，相對(duì)濕度35%～65%，正常光照。大鼠自由進(jìn)食、水，室內(nèi)照明分工作照明和動(dòng)物照明。動(dòng)物飼料及飲用水均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)規(guī)定由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部統(tǒng)一提供。實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的所有操作均按《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》進(jìn)行。

1.2試劑與儀器戊巴比妥鈉購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定(enzyme-linked immu nosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程公司，CD163抗體購(gòu)于美國(guó)Santa cruz公司，抗兔IgG AlexaFluor-596購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司；Cool-tip RFA儀購(gòu)于美國(guó)Covidien公司，半干TP1020組織脫水機(jī)、Arcadia組織石蠟包埋機(jī)、RM2265石蠟切片機(jī)、HVI1210攤片機(jī)、TP1020組織脫水機(jī)和HVI1210烤片機(jī)均購(gòu)于美國(guó)Leica公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及大鼠肝損傷炎癥模型建立將42只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)和RFA組(n=36)，RFA組大鼠根據(jù)處死時(shí)間再分為12、24、72、120、168、336 h組，每組6只。連接RFA各部分設(shè)備，接通電源，開(kāi)機(jī)運(yùn)行無(wú)異常后，待機(jī)。RFA組大鼠給予RFA術(shù)建立肝損傷炎癥模型，具體方法為：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(3 mL·kg-1)進(jìn)行麻醉后，固定于大鼠板，剃去上腹部及雙下肢內(nèi)側(cè)部毛發(fā)，粘貼電極板于雙下肢內(nèi)側(cè)部；上腹部備皮，常規(guī)消毒、鋪巾，沿右上腹部肋緣下做一長(zhǎng)約2 cm弧形切口，暴露肝臟右葉，垂直于肝臟組織插入1 cm射頻針(右后葉最厚處、大約深0.5 cm)，啟動(dòng)射頻機(jī)，射頻消融6 min(依據(jù)前期實(shí)驗(yàn))[9]，無(wú)菌紗布按壓針道，拔出射頻針，針道無(wú)出血后，間斷分層縫合切口(操作全程遵循外科手術(shù)無(wú)菌操作原則)；待大鼠麻醉蘇醒后，放回動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)，并觀察進(jìn)食、進(jìn)水、活動(dòng)情況及生存時(shí)間。對(duì)照組大鼠重復(fù)上述操作，但不啟動(dòng)射頻機(jī)。

1.3.2大鼠血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)和肝組織病理觀察12、24、72、120、168 h組分別于RFA術(shù)后12、24、72、120、168 h采用脫臼法處死大鼠，對(duì)照組大鼠于168 h時(shí)全部處死。大鼠處死后十字切開(kāi)腹部，解剖分離下腔靜脈，并采血5 mL，室溫靜止30 min，3 000 r·min-1離心5 min，小心收集上層血清，分裝于1 mL離心管中，放入-80 ℃冰箱待檢。采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)水平；采用7170A 全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。取肝臟，觀察肝臟大體形態(tài)；切取射頻部位、射頻周?chē)? cm組織于體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定，脫水，包埋，切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，封片，顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.3.3各組大鼠肝組織中M2型巨噬細(xì)胞檢測(cè)336 h組其余6只大鼠于336 h處死，制備肝組織石蠟切片。取對(duì)照組及12、24、72、120、168、336 h組大鼠肝組織石蠟切片進(jìn)行組織免疫熒光染色，CD163抗體(1100)標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞(紅色)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)標(biāo)記細(xì)胞核(藍(lán)色)，分別于波長(zhǎng)559 nm和340 nm激發(fā)光熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，Adobe Photoshop軟件合成圖片，應(yīng)用Image J軟件計(jì)算鏡下5個(gè)視野(×200倍)內(nèi)CD163+標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1大鼠RFA后一般情況及生存率RFA組大鼠術(shù)后麻醉恢復(fù)時(shí)間(29.0±2.0)min，平均每日進(jìn)食量(19.2±0.4)g，進(jìn)水量(33.2±1.1)mL，精神差，活動(dòng)度明顯減少，12、24、72 h組處死前生存率均為100%，120、168、336 h組處死前各死亡1只，生存率為83.3%。對(duì)照組大鼠麻醉恢復(fù)時(shí)間(10.0±3.0)min，平均每日進(jìn)食量(24.9±0.7)g，進(jìn)水量(47.8±1.1)mL，精神可，活動(dòng)無(wú)明顯影響，處死前生存率為100%。RFA組大鼠進(jìn)食及進(jìn)水量少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組大鼠RFA術(shù)后肝臟形態(tài)和病理學(xué)表現(xiàn)對(duì)照組大鼠肝臟與周?chē)M織無(wú)粘連，偶見(jiàn)網(wǎng)膜覆蓋，表面光滑，質(zhì)韌，紅褐色，針道周?chē)|(zhì)軟、輕度充血、水腫；HE染色可見(jiàn)肝小葉完整，偶見(jiàn)肝內(nèi)膽管、肝動(dòng)靜脈，肝細(xì)胞完整，核大且圓，居中，偶見(jiàn)雙核、多倍核(圖1A)。RFA組大鼠肝臟多見(jiàn)網(wǎng)膜覆蓋，表面欠光滑，針道周?chē)砻娲植?，質(zhì)硬，以針道為中心呈3個(gè)同心圓樣分布，分別為壞死區(qū)、交界區(qū)和炎癥充血區(qū)，依次為灰白色、灰綠色和鮮紅色；炎性充血區(qū)HE染色顯示明顯充血、水腫，肝細(xì)胞氣球樣變，可見(jiàn)灶狀變性壞死，肝小葉不完整，偶見(jiàn)肝內(nèi)膽管、肝內(nèi)動(dòng)靜脈扭曲、不完整，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞，偶見(jiàn)多形核白細(xì)胞(圖1B、圖1C)；72 h組大鼠肝組織中成纖維細(xì)胞分布于壞死交界區(qū)，可見(jiàn)多個(gè)核巨噬細(xì)胞，偶見(jiàn)不連續(xù)的小血管浸潤(rùn)(圖1D、圖1E)；168 h組大鼠肝組織中可見(jiàn)新形成的小血管及管內(nèi)紅細(xì)胞，大量纖維條索形成，肝細(xì)胞形成不規(guī)則形肝小葉(圖1F)。

A：對(duì)照組；B：12 h組；C：24 h組；D：72 h組；E：120 h組；F：168 h組。

圖1各組大鼠肝組織病理學(xué)變化(HE染色，×100)

Fig.1Pathologicalchangesoflivertissueineachgroup(HEstaining，×100)

2.3各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α及IL-10水平比較結(jié)果見(jiàn)表1。12、24、72、120、168 h組大鼠血清ALT、AST、TNF-α及IL-10水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24、72、120 h組大鼠ALT、AST、TNF-α及IL-10水平均高于12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。168 h組大鼠血清AST水平高于12 h組，TNF-α水平低于12 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；168 h組與12 h組大鼠血清ALT和IL-10水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。168 h組大鼠血清ALT、AST、TNF-α及IL-10水平均低于120 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；24、72、120 h組大鼠血清ALT、AST、TNF-α及IL-10水平組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組大鼠肝組織中M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率比較結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)照組、12、24、72、120、168、336 h組大鼠肝組織中M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為(9.5±0.4)%、(10.1±0.8)%、(10.9±0.5)%、(11.1±1.5)%、(18.7±0.8)%、(24.5±1.8)%和(6.8±0.4)%。168 h組大鼠肝組織中M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組和12、24、72、120、336 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.91、14.31、13.60、13.36、12.71、17.63，P<0.05)。

表1各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α和IL-10水平比較

組別nALT/(IU·L-1)AST/(IU·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-10/(ng·L-1)對(duì)照組688.3±2.1 150.3±3.5 51.0±3.5 93.5±6.8 RFA組 12 h組6109.9±2.8a124.6±6.7a81.1±3.6a112.4±7.5a 24 h組6137.6±7.4ab164.4±6.6ab98.8±2.3ab138.6±5.4ab 72 h組6157.8±9.2ab306.6±3.3ab150.1±2.7ab154.9±6.9ab 120 h組5133.6±5.8ab322.8±2.5ab97.2±2.1ab133.3±4.6ab 168 h組5114.1±4.1ac315.4±4.7abc63.8±1.7abc111.9±2.5ac

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與12 h組比較bP<0.05；與120 h組比較cP<0.05。

A：對(duì)照組；B：12 h組；C：24 h組；D：72 h組；E：120 h組；F：168 h組；G：336 h組。

圖2各組大鼠肝組織中M2型巨噬細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)(免疫熒光染色，×200)

Fig.2PositiveexpressionofM2macrophagesinlivertissuesofratsineachgroup(immunofluorescencestaining，×200)

3 討論

肝癌是發(fā)病率和致死率高的惡性腫瘤，RFA是一種新型微創(chuàng)技術(shù)，在肝癌治療中廣泛應(yīng)用，并取得顯著效果[10]，但RFA術(shù)后的炎癥微環(huán)境可促進(jìn)殘余腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致其不良預(yù)后的首要因素。RFA主要是在影像設(shè)備輔助下或術(shù)中直視下，將射頻電極直接插入臟器中，射頻發(fā)生器產(chǎn)生400～460 kHz 波，致電極周?chē)M織分子震蕩、摩擦、產(chǎn)熱，溫度達(dá)70～90 ℃，在局部熱損傷下致組織凝固性壞死，形成直徑3～5 cm球性壞死灶。本研究采用RFA建立熱損傷炎癥模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟熱損傷后肝細(xì)胞破裂，并釋放ALT、AST及大量炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-10，在RFA術(shù)后12 h ALT、AST、TNF-α及IL-10水平明顯升高，間接說(shuō)明RFA急性熱效應(yīng)在術(shù)后 12 h 時(shí)已經(jīng)引起肝損傷和急性炎癥反應(yīng)；120 h時(shí)ALT、AST、TNF-α及IL-10水平開(kāi)始降低，168 h時(shí)ALT、AST、TNF-α及IL-10水平較 120 h 時(shí)明顯降低，證實(shí)急性炎癥期已過(guò)；同時(shí)通過(guò)肝組織HE染色發(fā)現(xiàn)，RFA術(shù)后12 h時(shí)肝組織中有大量紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，更直觀證實(shí)了急性炎癥反應(yīng)的存在，72 h時(shí)可見(jiàn)肉芽組織開(kāi)始增生，120 h時(shí)可見(jiàn)纖維條索，168 h時(shí)可見(jiàn)不規(guī)則形肝小葉形成，有大量巨噬細(xì)胞聚集。但成麗等[11]通過(guò)刀片機(jī)械外力構(gòu)建斑馬魚(yú)的切尾炎癥模型，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)顯示，巨噬細(xì)胞聚集量在切割后6 h達(dá)巔峰值，8 h后開(kāi)始下降。本研究對(duì)照組大鼠應(yīng)用射頻針刺入肝臟(未接通電源)，造成肝機(jī)械損傷，168 h 處死后免疫熒光標(biāo)記M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為9.5%。KUMAR等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在假治療后，可標(biāo)記出M1型巨噬細(xì)胞(CD68+)，而本研究通過(guò)組織熒光標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠肝組織中存在M2型巨噬細(xì)胞，說(shuō)明機(jī)械刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化。KUMAR等[2]還發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝RFA術(shù)后72 h和168 h時(shí)，炎癥反應(yīng)帶中可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞聚集，且RFA術(shù)后168 h的纖維厚度明顯厚于術(shù)后72 h，本研究HE染色結(jié)果與此一致；術(shù)后168 h時(shí)因巨噬細(xì)胞已充分?jǐn)U散拉長(zhǎng)，無(wú)法量化陽(yáng)性細(xì)胞的百分比，而本研究免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)25%左右。ROZENBLUM等[12]研究發(fā)現(xiàn)，RFA術(shù)后炎癥反應(yīng)中M0型巨噬細(xì)胞(F4/80+)聚集達(dá)巔峰的時(shí)間是336 h。本研究主要標(biāo)記的是M2型巨噬細(xì)胞，在336 h時(shí)陽(yáng)性表達(dá)率僅6.8%。巨噬細(xì)胞的極化取決于其所處周?chē)h(huán)境，有研究發(fā)現(xiàn)，活化的脂多糖誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞更傾向于向M1型極化，然而活化后的IL-4/13則傾向于將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為M2型[13]。肝損傷炎癥模型的建立過(guò)程中產(chǎn)生大量循環(huán)免疫復(fù)合物，有研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)免疫復(fù)合物誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞主要表達(dá)為具有抗炎促修復(fù)作用的M2型[13]。ZHENG等[14]研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化后提取的肝巨噬細(xì)胞中，M2型巨噬細(xì)胞比例較高。本研究發(fā)現(xiàn)，RFA術(shù)后72 h時(shí)M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率開(kāi)始明顯升高，WAIDMANN等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷后12～24 h肝臟中單核源性巨噬細(xì)胞開(kāi)始明顯聚集，而Kupffer細(xì)胞明顯減少。巨噬細(xì)胞是免疫治療的重要成分，作為抗原遞呈細(xì)胞，可激活下游免疫[15]。本研究結(jié)果顯示，RFA術(shù)可誘導(dǎo)大鼠肝臟巨噬細(xì)胞極化為M2型，且在RFA術(shù)后168 h M2型巨噬細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率最高，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)可提取到較多的M2型巨噬細(xì)胞，為后續(xù)肝癌RFA術(shù)后炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的免疫治療研究和肝M2型巨噬細(xì)胞作用機(jī)制的體外研究提供一定的基礎(chǔ)支持。