陳清嬋，朱六云，張琴，畢強(qiáng)勝

(荊楚理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，湖北 荊門(mén) 448000)

野生葛根中富含異黃酮類、多糖類、氨基酸、微量元素等物質(zhì)，具有重要的藥理功能和藥用價(jià)值[1-3]。我國(guó)葛根資源豐富，多被加工成葛根茶、葛根粉等系列產(chǎn)品推向市場(chǎng)[4,5]。目前，大部分地區(qū)對(duì)葛根的利用還是以獲得葛根淀粉為目的，提取后的葛根渣作為廢棄物被填埋或焚燒[6]，這樣既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了資源。葛根纖維渣中含有豐富的葛根黃酮，對(duì)其的開(kāi)發(fā)利用將有益于提高葛根的附加值[7-10]。

食醋的生產(chǎn)歷史悠久，是一種應(yīng)用廣泛的調(diào)味品，味酸而醇厚，液香而柔和。隨著人們生活水平的日益提高、營(yíng)養(yǎng)保健意識(shí)的不斷增強(qiáng)，人們對(duì)食醋的認(rèn)識(shí)也不只是一種調(diào)味品,而更多地注重它的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值。本文在米醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中添加葛根渣，不僅有利于葛根渣中異黃酮的溶出，增強(qiáng)食醋的保健功能，同時(shí)為葛根渣的綜合利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米:荊門(mén)市市售；葛根渣：湖北仙之靈食品有限公司提供；安琪甜酒曲、安琪酵母：安琪股份有限公司；醋酸菌：濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；蘆丁(純度95%)：北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇、氫氧化鈉：武漢市洪山中南化工試劑有限公司，均為分析純；硝酸鋁、亞硝酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞：天津市福晨化學(xué)試劑廠，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

糖度計(jì)、酒精計(jì) 河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠；YXQ-LS-100S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SHZ-3循環(huán)水泵抽濾機(jī) 上海滬西分析儀器廠有限公司；1-1型鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；WY 200B恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；220恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；紫外分光光度計(jì) 普析通用儀器有限責(zé)任公司；2104電子分析天平 上海上天精密儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

浸泡：稱取大米浸泡3 h(用手輕捻便碎即可)。

蒸煮：浸泡后的大米放置于高壓滅菌鍋(121 ℃,20 min)蒸熟。

淋飯：趁熱用煮開(kāi)冷卻后的水沖淋，保持米粒完整。

糖化：淋飯后待米飯冷卻至30～35 ℃時(shí)均勻拌入甜酒曲，甜酒曲的量為原料大米干重的0.4%，在溫度為30 ℃下培養(yǎng)48 h。

調(diào)漿：加水將糖度調(diào)至10～13 °Bx。

酒精發(fā)酵：向糖化液中均勻接種不同比例的酵母，輕蓋瓶蓋，在不同試驗(yàn)溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵。

拌醅：按不同的比例將葛根渣與酒醅混合。

醋酸發(fā)酵：向酒醪中加入不同比例的醋酸菌，在不同試驗(yàn)溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵。

浸淋：向醋酸發(fā)酵液中加入等體積70～80 ℃的水浸泡1 h。

渣過(guò)濾：用細(xì)紗過(guò)濾布過(guò)濾浸淋后的發(fā)酵液，棄除濾渣，取清液。

1.3.3 酒精發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酒精發(fā)酵是食醋釀造必經(jīng)的生化過(guò)程，主要作用是將糖化后的還原糖經(jīng)酵母菌的發(fā)酵作用轉(zhuǎn)化為乙醇[11]。因此待糖化結(jié)束以后，開(kāi)始接種酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，以發(fā)酵結(jié)束后的酒精含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酵母菌添加量、發(fā)酵初始溫度、發(fā)酵時(shí)間，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，對(duì)酒精發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.3.4 醋酸發(fā)酵

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

a.葛根渣添加量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

按照葛根渣與酒精發(fā)酵液的比例分別是1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6添加葛根渣，每份均勻添加0.5%的醋酸菌，在38 ℃和7天的條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醋酸和黃酮的含量。

b.醋酸菌接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

葛根渣與發(fā)酵液的比例是1∶4，接種醋酸菌量分別為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，在38 ℃和7天的條件下發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醋酸和黃酮的含量。

c.溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

葛根渣與發(fā)酵液的比例是1∶4，接種醋酸菌量為0.5%，分別在30，34，38，42，46 ℃的條件下發(fā)酵7天，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醋酸和黃酮的含量。

d.時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

葛根渣與發(fā)酵液的比例是1∶4，接種醋酸菌量為0.5%，在38 ℃條件下分別發(fā)酵5，6，7，8，9天, 發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醋酸和黃酮的含量。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以醋酸含量和黃酮含量為考察指標(biāo)，選擇醋酸發(fā)酵溫度、葛根渣添加量、醋酸菌接種量和發(fā)酵時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，確定醋酸發(fā)酵條件的最優(yōu)化組合，各因素水平具體見(jiàn)表2。

化學(xué)具有較強(qiáng)的實(shí)踐性與規(guī)律性，因此實(shí)驗(yàn)是其重要的組成部分，對(duì)實(shí)驗(yàn)規(guī)律的總結(jié)與凝練是備課工作的又一項(xiàng)重點(diǎn)工作.對(duì)于學(xué)生而言，實(shí)驗(yàn)操作可以幫助他們更直觀地理解化學(xué)反應(yīng)與化學(xué)現(xiàn)象，而之后的總結(jié)可以幫助他們認(rèn)識(shí)到反映的本質(zhì)與應(yīng)用的可能性，兩者結(jié)合可以有效提升自身的化學(xué)專業(yè)素養(yǎng).

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal test

1.3.5 測(cè)定方法

糖度測(cè)定：使用手持糖度儀。

酒精度測(cè)定：向蒸餾設(shè)備的圓底燒瓶中加入酒精發(fā)酵液和純水各100 mL，收集100 mL的蒸餾液并用酒精計(jì)測(cè)量，同時(shí)用溫度計(jì)測(cè)定溶液溫度，換算成20 ℃時(shí)的酒精度。

酸度測(cè)定：采用酸堿中和滴定法[12]。

黃酮測(cè)定：分光光度法[13]。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別移取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于已編號(hào)的試管中，加入30%乙醇補(bǔ)充至5 mL,加入300 μL 5% NaNO2搖勻，放置5 min；再加入30 μL 10% Al(NO3)3，放置6 min后加入2 mL 1 mol/L NaOH搖勻，用30%乙醇定容至10 mL，10 min后于510 nm波長(zhǎng)處(以不加蘆丁為空白)比色測(cè)定。以黃酮濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值y為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=1.1565x (R2=0.9818)。

醋樣品總黃酮的測(cè)定：取200 μL樣品溶液于5 mL比色管中，加入30%乙醇補(bǔ)充至2.5 mL，加入150 μL 5% NaNO2搖勻，放置5 min, 再加入150 μL 10% Al(NO3)3，放置6 min后加入1 mL 1 mol/L NaOH混勻，用30%乙醇定容至5 mL，10 min后于510 nm波長(zhǎng)處(以不加樣品為空白)比色測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和稀釋倍數(shù)計(jì)算總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化

表3 酒精發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of ethanol fermentation process conditions

由表3可知，在發(fā)酵條件對(duì)酒精度的影響中，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)極差R值的比較，極差越大，對(duì)酒精發(fā)酵的影響越大。因而影響酒精度大小的3個(gè)要素按次序?yàn)锽(發(fā)酵時(shí)間)>C(發(fā)酵溫度)>A(酵母菌接種量)，再通過(guò)對(duì)k值的大小比較，得到發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合為：A2B2C3，即發(fā)酵時(shí)間為5天，發(fā)酵溫度為30 ℃，酵母菌接種量為0.4%。正交表有該組合，且酒精度大小為13.4%，酒精度達(dá)到最大值。

2.2 醋酸發(fā)酵

2.2.1 不同發(fā)酵條件對(duì)醋酸及黃酮含量的影響

2.2.1.1 發(fā)酵液與葛根渣之比對(duì)醋酸發(fā)酵及黃酮含量的影響

圖1 葛根渣添加量對(duì)醋酸含量和黃酮含量的影響Fig.1 Effect of the additive amount of Pueraria lobata dreg on the content of acetic acid and flavonoids

由圖1可知，隨著發(fā)酵液與葛根渣比值的增大，醋酸含量及黃酮含量均表現(xiàn)為先增后減，說(shuō)明葛根渣比例過(guò)低不利于醋酸生成。發(fā)酵液與葛根渣之比為5∶1時(shí)，醋酸含量最高，為0.24 mol/L。而發(fā)酵液與葛根渣之比為4∶1時(shí)，黃酮含量最高，為4.44 mg/L，其后黃酮含量變化不大。因此，將發(fā)酵液與葛根渣之比為4∶1，5∶1，6∶1選作正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.1.2 醋酸菌添加量對(duì)醋酸發(fā)酵及黃酮含量的影響

圖2 醋酸菌添加量對(duì)醋酸和黃酮含量的影響Fig.2 Effect of the additive amount of acetic acid bacteria on the content of acetic acid and flavonoids

由圖2可知，隨著醋酸菌添加量的增大，醋酸含量先增后減，在醋酸菌添加量為0.6%時(shí)達(dá)最大值，為0.27 mol/L，之后醋酸菌添加量增加，醋酸含量明顯減少，其原因可能是發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限僅能滿足過(guò)多的醋酸菌生長(zhǎng)需求，不足以生成醋酸；黃酮含量隨著醋酸添加量的增大而增大，有持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這可能是由于醋酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中，利用了葛根渣中的某些營(yíng)養(yǎng)成分，有利于黃酮類物質(zhì)的釋放。因此，綜合考慮，選用醋酸添加量0.5%，0.6%，0.7%作為正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵及黃酮含量的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸和黃酮含量的影響Fig.3 Effect of the fermentation temperature on the content of acetic acid and flavonoids

由圖3可知，隨著溫度的升高，醋酸及黃酮的含量均呈鐘形曲線的趨勢(shì)變化，當(dāng)溫度在30～38 ℃時(shí)，醋酸和黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)溫度達(dá)到38 ℃時(shí)，醋酸含量及黃酮含量達(dá)到最大值，醋酸含量為0.3 mol/L，黃酮含量為5.34 mg/L；當(dāng)溫度在38～46 ℃時(shí)，醋酸含量及黃酮含量均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，由此可見(jiàn)，發(fā)酵溫度對(duì)醋酸及黃酮含量有直接影響。因此，將發(fā)酵溫度為34，38，42 ℃選作正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵及醋酸含量的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸和黃酮含量的影響Fig.4 Effect of the fermentation time on the content of acetic acid and flavonoids

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，醋酸含量及黃酮含量均在第6天達(dá)到最大值，醋酸含量為0.3 mol/L，黃酮含量為7.45 mg/L。第6天之后醋酸和黃酮含量均開(kāi)始下降，可能的原因是隨著時(shí)間的推移，醋酸被進(jìn)一步代謝生成CO2和水，黃酮類物質(zhì)也可能降解。因此，將發(fā)酵時(shí)間為5，6，7天選作正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.2 醋酸發(fā)酵的正交試驗(yàn)分析結(jié)果

選取發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵液葛根渣比例(B)、菌種接種量(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)為主要影響因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 4 因素3水平，按照L9(34)安排正交試驗(yàn)，以確定醋酸發(fā)酵工藝，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 醋酸發(fā)酵工藝條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of acetic acid fermentation process conditions

續(xù) 表

由表4可知，醋酸含量為參考指標(biāo)，通過(guò)極差R值的比較，極差越大，因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響越大。因而影響醋酸含量的4個(gè)因素主次為B(發(fā)酵液與葛根渣之比)>C(醋酸菌添加量)>A(發(fā)酵溫度)>D(發(fā)酵時(shí)間)，再通過(guò)對(duì)k值的大小比較，得到發(fā)酵工藝的最優(yōu)組合為A1B2C3D2；以黃酮含量為參考指標(biāo)，通過(guò)對(duì)極差R值的比較，可以得出影響黃酮含量的4個(gè)因素主次順序?yàn)镃(醋酸菌添加量)>D(發(fā)酵時(shí)間)>A(發(fā)酵溫度)>B(發(fā)酵液與葛根渣之比)，再通過(guò)對(duì)k值的大小比較，得出最優(yōu)組合為A1B2C3D2。由此可見(jiàn)醋酸發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)為A1B2C3D2，即發(fā)酵溫度為34 ℃，發(fā)酵液與葛根渣之比為5∶1，醋酸菌添加量為0.7%，發(fā)酵時(shí)間為6天。正交表沒(méi)有該組合，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，A1B2C3D2組的醋酸含量可達(dá)到0.63 mol/L，黃酮含量為7.69 mg/L，醋酸含量及黃酮含量均達(dá)到最高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以秈米和葛根渣為主要原料，采用單因素和正交試驗(yàn)得出了在不同條件下葛根各指標(biāo)的最優(yōu)方案。酒精發(fā)酵階段的最佳條件為酵母添加量0.4%，發(fā)酵時(shí)間5天，發(fā)酵溫度30 ℃。此條件下可得發(fā)酵液的酒精度為13.4%；醋酸發(fā)酵階段的最佳條件為發(fā)酵液∶葛根渣5∶1，發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時(shí)間6天，醋酸菌添加量為0.7%，此條件下可測(cè)得葛根的酸度為0.63 mol/L，黃酮濃度為7.69 mg/L。

本試驗(yàn)利用提取淀粉后的葛根渣仍有相當(dāng)量的葛根異黃酮和膳食纖維,充分發(fā)揮了葛根的保健功能,且將其變廢為寶，既環(huán)保又提高了經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)擴(kuò)大葛根產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)有著重要的意義。這種利用醋酸釀造工藝的生物轉(zhuǎn)化模式為藥食兼用的葛根提供了一條新的開(kāi)發(fā)途徑。