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        泡菜中高效氨氮降解菌的篩選及鑒定

        2018-10-22 12:06:34馮愛娟朱美娟陳美娟蘇莉莎葉茂
        中國調(diào)味品 2018年10期
        關(guān)鍵詞:泡菜氨氮波長

        馮愛娟,朱美娟,陳美娟,蘇莉莎,葉茂*

        (1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與生物技術(shù)學(xué)院,廣州 510300;2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心,廣州 510300)

        近年來,由于工業(yè)的快速發(fā)展,排出的廢水急劇增加,導(dǎo)致水污染的原因有很多,如有機(jī)污染物、無機(jī)污染物等,其中廢水中氨氮含量嚴(yán)重超標(biāo)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化,危害環(huán)境。氨氮是水相環(huán)境中氨的主要形態(tài),是造成水體富營養(yǎng)化的主要污染物。因此,氨氮的含量可以作為污水水質(zhì)的重要指標(biāo)。水體污染給環(huán)境和人類的生活造成了威脅[1,2]。根據(jù)搜查的相關(guān)資料,氨氮含量的排放量劇增,造成氮循環(huán)不規(guī)律[3],為保證水資源的可持續(xù)發(fā)展,開發(fā)出更高效的氨氮處理技術(shù)成為目前迫在眉睫的事情?,F(xiàn)今,國內(nèi)外對高氨氮廢水處理方面也展開了較多研究,除了傳統(tǒng)的方法外,還有現(xiàn)推行的方法生物脫氮技術(shù)[4],生物脫氮是利用從自然界中獲得的有益微生物降解氨氮,生物脫氮技術(shù)具有無污染、經(jīng)濟(jì)和安全等優(yōu)點,因此更加備受關(guān)注。生物脫氮技術(shù)的核心是篩選能高效降解氨氮的微生物,所以前人對這方面進(jìn)行了大量的研究工作。近十幾年來,很多學(xué)術(shù)上的學(xué)者從研究河蝦等水殖產(chǎn)業(yè)的污水、某工業(yè)地的淤泥中篩選出能降解廢水中氨氮的菌株,相關(guān)文獻(xiàn)報道過的有硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、高效脫氮除磷菌等降解氨氮的菌株[5],在這方面也有了一定的進(jìn)展。眾多研究結(jié)果表明,高氨氮污水及污泥中篩選高效菌株是最為有效的優(yōu)良菌劑獲取方法,但盡管目前投入了大量的嘗試性研究,還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到有效、節(jié)約地處理污水氨氮的程度。因此,應(yīng)對目前全國范圍內(nèi)各種污染類型水體中普遍發(fā)生的氨氮超標(biāo)問題,篩選出高效菌株并對其性能進(jìn)行優(yōu)化仍是當(dāng)前及未來的主要研究方向。我們也向著這個方向出發(fā),研究以市售泡菜為原材料,使用富集與分離的方法篩選氨氮降解菌,通過測定其氨氮降解率以獲得1株高效的氨氮降解菌株,并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化,期望能為我國處理水體的氨氮提供一條新途徑。

        1 實驗材料與方法

        1.1 泡菜樣品

        泡菜樣品:市售。

        1.2 培養(yǎng)基

        1.2.1 富集培養(yǎng)基

        葡萄糖5.0 g,(NH4)2SO42.5 g,NaCl 2.0 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g,K2HPO41.0 g,pH值7.2~7.4,MgSO4·7H2O 0.5 g,水1000 mL。取200 mL富集培養(yǎng)基放入1000 mL錐形瓶中,115 ℃滅菌30 min。

        1.2.2 分離平板培養(yǎng)基

        葡萄糖5.0 g,(NH4)2SO42.5 g,NaCl 2.0 g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g,K2HPO41.0 g,pH值7.2~7.4,MgSO4·7H2O 0.5 g,瓊脂20 g,水1000 mL,115 ℃滅菌30 min。

        1.2.3 活化培養(yǎng)基

        蛋白胨5 g,葡萄糖5 g,K2HPO42 g,NaCl 5 g,水1000 mL,pH值7.0~7.2,過濾分裝后于115 ℃滅菌30 min。

        1.2.4 斜面培養(yǎng)基

        采用Luria-Bertani (LB)瓊脂培養(yǎng)基,其組成如下:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,NaCl 10 g/L和瓊脂20 g/L。將pH調(diào)至7.5,121 ℃滅菌20 min。

        1.2.5 搖瓶種子培養(yǎng)基

        采用LB液體培養(yǎng)基,將pH調(diào)至7.5,121 ℃滅菌20 min。

        1.2.6 篩選培養(yǎng)基

        葡萄糖5.0 g,(NH4)2SO42.5 g,NaCl 1.0 g,K2HPO40.5 g,pH值7.2~7.4,MgSO4·7H2O 0.25 g,去離子水定容至1000 mL,此時NH4-N含量為500 mg/L,分裝于1000 mL三角瓶中,每瓶200 mL,115 ℃滅菌30 min。

        1.3 分離篩選出氨氮降解菌

        1.3.1 氨氮降解菌的富集

        配制好190 mL富集培養(yǎng)基,滅菌、冷卻后,從混合均勻的泡菜樣品中取出30 g,接入裝有富集培養(yǎng)基的1000 mL三角瓶中,搖勻,再放入150 r/min,28 ℃的恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后測定pH值;然后取出10 mL上清菌液,加到新鮮富集培養(yǎng)基中在相同條件下再次富集培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后再測定pH值,觀察從培養(yǎng)基到富集2次后的pH值的變化情況。

        1.3.2 氨氮降解菌的分離純化

        配制好分離平板培養(yǎng)基,滅菌、分裝、冷卻后,取第2次富集培養(yǎng)基中的上清菌液1 mL,在無菌操作條件下將培養(yǎng)液稀釋、涂布于分離平板培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~3天,至平板長出單菌落為止;挑取各個單菌落至新的平板上劃線,28 ℃下培養(yǎng)2~3天,至平板上長出單菌落為止,以進(jìn)一步純化;挑選各個單菌落于斜面培養(yǎng)基上,于28 ℃下培養(yǎng)24 h;待斜面長出菌苔后,分別以斜面固態(tài)保藏于4 ℃冰箱和中制成甘油管保藏于-20 ℃冰箱中。

        1.3.3 制備菌懸液及測定細(xì)胞濃度

        將活化后的各菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基;各接入1環(huán),于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h;在4 ℃、10000 r/min下離心15 min并棄上清液,收集菌體;將濕菌體加至無菌的生理鹽水中洗滌3~4次[6],測定OD600=1,并將其配制成細(xì)胞濃度約為109個/mL的菌懸液備用。

        1.3.4 篩選高效降解菌

        制備搖瓶篩選培養(yǎng)基190 mL加入1000 mL的三角瓶中,滅菌、冷卻后,分別接入各菌株的細(xì)胞濃度相等的菌懸液;置于150 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h;采用《水楊酸分光光度法》分析經(jīng)各菌種降解后的培養(yǎng)基中的氨氮殘留量(24,48,72 h各測1次);用未接種的搖瓶做參照,記錄數(shù)據(jù)并計算氨氮降解率。參照文獻(xiàn)[7]中提出的方法,并按式(1)計算菌株的氨氮降解率:

        (1)

        綜合數(shù)據(jù),根據(jù)降解率的大小,優(yōu)選出降解效率最高的目的菌株。

        1.3.5 高效降解菌菌株最大吸收波長的測定

        配制好100 mL活化培養(yǎng)基,滅菌、冷卻后,將優(yōu)選出的菌株在活化培養(yǎng)基中活化24 h(將斜面保藏的菌種接1環(huán)到活化培養(yǎng)基中,置于28 ℃和150 r/min條件下培養(yǎng)24 h),取培養(yǎng)液用紫外-可見光分光光度儀在340~600 nm的波長下以未接種的培養(yǎng)基為參比測定其OD值,以波長為橫坐標(biāo),以O(shè)D值為縱坐標(biāo)畫圖,確定該優(yōu)選菌株的最大吸收波長。

        1.3.6 高效降解菌菌株的生長曲線測定

        將活化好的優(yōu)選菌株,接1環(huán)至新鮮的活化培養(yǎng)基,在28 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng),在該優(yōu)選菌株的最大吸收波長處,每隔2 h取一定量培養(yǎng)液測定其OD值,以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),以最大吸收波長處的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

        1.3.7 氨氮降解菌菌株的初步鑒定

        對優(yōu)選菌種進(jìn)行平板培養(yǎng)、革蘭氏染色,觀察其菌落形態(tài)及革蘭氏屬性。同時,參照文獻(xiàn)[8-10],如《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的方法,對生理生化特征等方面進(jìn)行初步鑒定,如葡萄糖發(fā)酵試驗、需氧性試驗等。

        1.3.8 菌株的16S rDNA測序

        氨氮降解菌菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增引物采用通用引物:正向引物27F為5′-AGAGTTTGATCC-

        TGGCTCA-3′,反向引物1492R為5′-GGTTACCTTG-

        TTACGACTT-3′(由上海生物工程有限公司合成),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測后送上海生物工程有限公司測序,將測得序列通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST比對,找出核酸數(shù)據(jù)庫中與氨氮降解菌菌株同源性較高的菌株序列,下載這些菌株的DNA序列,然后用生物軟件MEGA4進(jìn)行CLUSTAL比對并構(gòu)建氨氮降解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

        2 實驗結(jié)果

        2.1 分離篩選高效氨氮降解菌的結(jié)果

        富集實驗的情況如下:第1天富集后pH為6.10;第2天為4.5,說明富集的菌株是產(chǎn)酸的;分離純化試驗:從泡菜原材料中共篩選了25株能降解高濃度氨氮的菌株;最后對這25株菌進(jìn)行了氨氮降解率的測定實驗。結(jié)果表明:在氨氮濃度為500 mg/L的液體培養(yǎng)基下,24 h內(nèi)這些菌株氨氮降解率的范圍為3.85%~29.81%;48 h的氨氮降解率范圍為13.46%~43.64%,72 h的氨氮降解范圍為35.72%~64.85%。由于硫酸銨在培養(yǎng)基滅菌過程中會出現(xiàn)高溫分解,從而導(dǎo)致NH4-N的濃度降低,因此在培養(yǎng)基的配制過程中采用先不加硫酸銨滅菌后,通過過濾除菌將硫酸銨加入到培養(yǎng)基中后接種培養(yǎng)。試驗表明:LJK8菌株的降解率最高為 64.85%,因此對LJK8菌株做進(jìn)一步的研究。

        2.2 LJK8菌株最大吸收波長的測定

        LJK8菌株吸收波長實驗結(jié)果見圖1。

        圖1 LJK8菌株吸收波長Fig.1 The maximum absorbing wavelength of LJK8 strain

        由圖1可知,在波長340~600 nm之間,LJK8菌株在380 nm處有最大吸收峰,由此在380 nm處測其生長曲線,以研究其生長量與氨氮降解率之間的關(guān)系。

        2.3 LJK8菌株的生長曲線測定

        LJK8菌株的生長曲線測定結(jié)果見圖2。

        圖2 LJK8菌株的生長曲線Fig.2 The growth curve of LJK8 strain

        由圖2可知,LJK8菌株在0~6 h為生長的適應(yīng)期;在6~14 h為對數(shù)生長期;在14~36 h為生長的穩(wěn)定期;在36 h之后才有所衰亡。LJK8菌株達(dá)到最大生長量是在培養(yǎng)第20 h。

        2.4 LJK8菌株的初步鑒定

        觀察LJK8菌株的平板培養(yǎng)情況,(見圖3),菌落為乳白色但不透明,圓形,邊緣整齊。菌株經(jīng)革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察(見圖4),細(xì)胞完全是細(xì)桿狀,均為紫色,因此屬于革蘭氏陽性菌且無芽孢。

        圖3 LJK8菌株的菌落形態(tài)Fig.3 Colony of LJK8 strain

        圖4 LJK8菌株的革蘭氏染色圖Fig.4 Gram staining of LJK8 strain

        2.5 LJK8菌株的生理生化試驗

        經(jīng)過一系列的生理生化試驗,觀察結(jié)果,見表1。

        表1 生理生化試驗結(jié)果Table 1 The results of physiological and biochemical test

        2.6 LJK8菌株的16S rDNA測定結(jié)果

        將LJK8菌株的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖5??梢猿醪借b定LJK8菌株屬于Rheinheimeraaquatica(水萊茵海默氏菌),擴(kuò)增的16S rDNA與Rheinheimeraaquatica序列相似性達(dá)到99.99%,序列同源性為98%,所以初步確定該菌株為Rheinheimeraaquatica。

        LJK8菌株的16S rDNA序列:

        CGTAGGAAGCTACCCGATAGAGGGGGATACCAGTTGGAAACGACTGTTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGTGTGGGACCTTCGGGCCACATGCTATCGGATGCGCCTACGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTTGGGAGGAAGGGTTGTGTGTTAATAGTACACAGCCTTGACGTTACCAACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGAAGCGCACGTAGGCGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTGTGTGAGAGGGGGGTAGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGCACAACACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGCTGTTCGTGACCTTGTGTCGTGAGTAGCGCAGCTAACGCACTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAAGACTGCAGAGATGCGGTTGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTAGTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTATGTACAGAGGGAGGCAAGCTGGCGACAGTGAGCGGATCTCTTAAAGCATATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAAATCAGAATGTTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA。

        圖5 LJK8的16S rDNA序列比對結(jié)果Fig.5 16S rDNA sequence comparison results of LJK8 strain

        3 討論

        從鹽含量高的泡菜為原料,以硫酸銨為唯一氮源的篩選培養(yǎng)基,篩選出具有氨氮降解能力的微生物,再進(jìn)行分離和純化,篩選出1株對高氨氮含量水相具有較高降解效率的菌株LJK8。經(jīng)過測定,LJK8的最大波長及生長曲線、革蘭氏染色及對其進(jìn)行的一系列生理生化試驗,可以初步了解LJK8菌株的基本屬性。LJK8菌株的最適吸收波長在380 nm處,由其生長曲線可以看出,LJK8菌株在培養(yǎng)14 h時達(dá)到最大生長量;當(dāng)以氨氮初始含量為500 mg/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)時,并測定其氨氮降解率,在24~72 h內(nèi)的降解效率達(dá)到64.85%,通過對LJK8菌株生長量及氨氮含量變化的檢測,表明菌株生長與降解氨氮是同步進(jìn)行的,說明其可在較長時間內(nèi)發(fā)揮降解作用。

        目前對能處理水體或者土壤中氨氮的文獻(xiàn)報道還比較少,而我們研究從泡菜中篩選出來的高效氨氮降解菌LJK8菌株屬于Rheinheimeraaquatica(水萊茵海默氏菌),還未見該菌用于氨氮降解的報道,LJK8如果應(yīng)用于水體污染的處理方面還有很大的發(fā)展?jié)摿Γ虼丝蓪ζ湓陴B(yǎng)殖污水、工業(yè)污水或者土壤中氨氮的深度凈化處理上的應(yīng)用再進(jìn)一步進(jìn)行研究。不過篩選出來的LJK8菌株相對于同一時段篩選的其他菌株的氨氮降解效率雖然較高,但是在如此高濃度的氨氮條件下仍然還有相當(dāng)量的氨氮殘留,因此我們后期將會研究該菌的降解工藝,并對其降解條件進(jìn)行優(yōu)化,增強(qiáng)菌株對高濃度氨氮污水的凈化能力。期望LJK8能在后期的養(yǎng)殖污水及水體污染處理方面發(fā)揮一定的作用。

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