李迪

摘要：CRISPR/Cas系統(tǒng)是古菌、細菌等在長期進化過程中形成的獲得性免疫系統(tǒng)。以Cas9蛋白為核心的Ⅱ型系統(tǒng)經(jīng)改造后成本低、歷時短、操作簡單，在植物、動物領(lǐng)域都取得了許多成果。本綜述介紹了CRISPR/Cas的產(chǎn)生、作用機制、應(yīng)用前景等，為CRISPR/Cas系統(tǒng)相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：CRISPR/Cas；基因定點編輯；分子機制；應(yīng)用前景

一、發(fā)現(xiàn)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是廣泛存在于古菌、細菌等的一種獲得性免疫系統(tǒng)，是這些生物防御病毒、質(zhì)粒等入侵自身基因組的外源遺傳物質(zhì)的“武器”。1987年日本研究人員首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一些間隔的短回文序列，但尚不了解其意義。2002年Jansen等將這種序列正式命名為CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），即成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列。2005年多項研究顯示CRISPR的間隔區(qū)與噬菌體或質(zhì)粒序列有高度同源性。2007年Barrangou等發(fā)現(xiàn)通過增加和敲除嗜熱鏈球菌中的CRISPR序列可改變該菌對噬菌體的免疫力。科研人員還發(fā)現(xiàn)在CRISPR序列周圍存在可編碼核酸酶、解旋酶等的Cas基因。2012年Jennifer等發(fā)現(xiàn)了一個簡單的CRISPR/Cas系統(tǒng)，它通過Cas9核酸內(nèi)切酶以及以CRISPR序列為模板轉(zhuǎn)錄出來的兩種RNA就可以剪切dsDNA。2013年FengZhang等首次證實CRISPR/Cas9可對人類內(nèi)源基因進行定向切割。隨著研究人員的不懈努力以及科學技術(shù)的快速發(fā)展，目前CRISPR/Cas技術(shù)在植物、動物等領(lǐng)域已經(jīng)帶來了許多優(yōu)秀成果。

二、結(jié)構(gòu)與分類

完整CRISPR位點依次包括Cas基因，前導(dǎo)區(qū)，由短回文重復(fù)序列（repeat）和間隔區(qū)（spacer）構(gòu)成的CRISPR序列。上游Cas基因有豐富的多態(tài)性，編碼蛋白有核酸酶的功能。前導(dǎo)區(qū)可看作CRISPR序列的啟動子，激活轉(zhuǎn)錄。下游CRISPR序列中的回文序列長度一般在21～48bp，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。[1]間隔區(qū)即細菌捕獲的外源DNA，相當于細菌建立的“黑名單”，當入侵者再次來襲細菌可立即識別并應(yīng)答，即所謂的獲得性免疫系統(tǒng)。隨著多種細菌基因組測序的相繼完成，越來越多的CRISPR/Cas系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)。目前依據(jù)Cas基因可把已發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。研究最為透徹的是Ⅱ型，它包括2個亞型，標記基因為Cas9，編碼蛋白含有RuvC、HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域。

三、Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的分子作用機制

不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)在執(zhí)行其功能時所涉及的Cas蛋白的種類及數(shù)目不同。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)都需要多種Cas蛋白形成的復(fù)合體參與，Ⅱ型系統(tǒng)只需Cas9就能完成對dsDNA的切割。本綜述主要介紹Ⅱ型系統(tǒng)的分子作用機制。

（一）外源DNA捕獲

外源DNA首次攻擊細菌時，Cas基因合成Cas1和Cas2形成蛋白復(fù)合體，從外源DNA中切割一段序列（即原間隔序列protospacer）作為二次免疫的“憑證”，插入到宿主原CRISPR序列中成為間隔序列之一。protospacer兩端的幾個堿基非常保守，通常為NGG，稱為原間隔序列鄰近基序（PAM）。外源DNA入侵時，Cas1和Cas2蛋白復(fù)合體對其掃描，識別PAM序列后完成切割，整合到宿主CRISPR序列5端，形成新的CRISPR序列。

（二）crRNA的合成

當同種入侵者再次攻擊宿主細菌時，前導(dǎo)區(qū)激活CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，其中repeat合成tracrRNA，整個CRISPR序列合成PrecrRNA，二者組成具有二級結(jié)構(gòu)的復(fù)合體，招募Cas9蛋白。RNaseⅢ協(xié)助選定并切割對應(yīng)spacer，形成最終crRNA、tracrRNA、Cas9復(fù)合體。

（三）靶向干擾

復(fù)合體一旦識別到與crRNA互補的protospacer，將結(jié)合到對應(yīng)的PAM附近。使目標外源dsDNA解旋后，crRNA與帶protospacer的互補鏈結(jié)合，Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域?qū)パa鏈進行切割，RucV結(jié)構(gòu)域則對非互補鏈進行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），外源DNA被沉默，宿主完成二次免疫。

四、CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的發(fā)展

CRISPR/Cas系統(tǒng)使外源dsDNA產(chǎn)生DSB后將引起HR或NHEJ，實現(xiàn)靶基因的敲入與敲除。傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）。ZFNs和TALENs均由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、核酸酶結(jié)構(gòu)域融合而成，但這兩項技術(shù)花費高、操作難度大、歷時長、易脫靶。CRISPR/Cas系統(tǒng)能對多靶位點同時進行編輯，在Cas9確定的條件下只需要設(shè)計特異的guideRNA即可切割，成本低，因此逐漸興起。

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)以crRNA與tracrRNA形成的嵌合分子為原型，設(shè)計針對靶位點的sgRNA，介導(dǎo)切割，產(chǎn)生DSBs。Hwang等[2]利用CRISPR/Cas9在斑馬魚胚胎中實現(xiàn)drd3、gsk3b的定點突變，這是TALENs尚不能完成的。WANG等[3]將sgRNA與Cas9mRNA導(dǎo)入小鼠受精卵中，首次在動物體內(nèi)實現(xiàn)同時敲除2個內(nèi)源基因即Tet1和Tet2。Niu等[4]以食蟹猴受精卵為材料同樣利用此法成功干擾PPARγ和RAG1，首次在靈長類實現(xiàn)CRISPR/Cas9基因修飾。Zhang等給Cas9蛋白加上激活類結(jié)構(gòu)域，成功激活10個人源基因，建立人類sgRNA文庫進一步豐富基因組注釋。Gao等[5]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)完成了4個水稻基因、1個小麥基因的定點編輯，并在T0代獲得了水稻PDS基因缺失的純合突變體。此外該研究組通過在DSB引入HR修復(fù)途徑實現(xiàn)12bp序列的knockin，使CRISPR/Cas系統(tǒng)在重要經(jīng)濟農(nóng)作物的育種方面前景更加開闊。Zhu等[6]利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對擬南芥11個靶位點成功誘導(dǎo)突變，突變后代經(jīng)分析符合孟德爾定律。

CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯中最明顯的問題就是脫靶現(xiàn)象。gRNA可能會與PAM序列鄰近8～12bp區(qū)域錯配從而對非靶位點進行編輯。因此目前提高精確度是更大程度上發(fā)揮CRISPR/Cas系統(tǒng)作用的切入點。CRISPR/Cas系統(tǒng)為基因組定點編輯技術(shù)增添了濃墨重彩的一筆，其成本低，歷時短，操作簡單，多數(shù)相關(guān)實驗室都能進行課題研究。在植物領(lǐng)域內(nèi)通過對水稻、小麥等重要農(nóng)作物進行高效的分子育種，使產(chǎn)量、抗性品質(zhì)達到較理想的狀態(tài)。在動物領(lǐng)域內(nèi)通過構(gòu)建小鼠、靈長類等的突變體，對遺傳疾病、腫瘤分子機制的研究與靶向治療，為人類帶來更多福音。

參考文獻：

[1]王瑋瑋，等.CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進展及其在動物基因編輯研究中的應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學報，2016，47（07）：12991305.

[2]HwangWY，etal.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（3）：227229.

[3]WANGH，etal.OnestepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbyCRISPR/Casmediatedgenomeengineering[J].Cell，2013，153：910918.

[4]NIUY，etal.GenerationofgenemodifiedcynomolgusmonkeyviaCas9/RNAmediatedgenetargetinginonecellembryos[J].Cell，2014，156：836843.

[5]GaoCX，etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPRCassystem.NatBiotechnol，2013，31（8）：686688.

[6]ZhuJK，etal.EfficientgenomeeditinginplantsusingaCRISPR/Cassystem.CellRes，2013，23（10）：12291232.