黃璐璐 杜倩倩 閆辰 劉春霞 李芋潤 高林 李燕 趙青

摘要 目的：初步探討由山楂、沙棘和枸杞三味中藥為主，并添加蟲草素、蟲草多糖、β-葡聚糖和番茄紅素等制備而成的天然藥物組方睿臻的體內(nèi)外抗肺癌活性及其機(jī)制。方法：采用MTT法檢測(cè)睿臻體外抗腫瘤活性，小鼠Lewis移植瘤模型觀察單獨(dú)使用睿臻及聯(lián)合紫素的抗肺癌活性及對(duì)荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響。FCM實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，重組基質(zhì)膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，Westernblot方法初步探討該化合物的作用機(jī)制。結(jié)果：睿臻對(duì)肺癌細(xì)胞具有較好的增殖抑制活性，其作用于A549細(xì)胞株、NCI-H460細(xì)胞株和NCI-H1975細(xì)胞株120h后的IC50值分別為98.42μg/mL、60.02μg/mL和60.41μg/mL；睿臻也可顯著抑制小鼠Lewis肺癌的生長，9.0g/kg睿臻對(duì)小鼠Lewis肺癌的生長抑制率達(dá)70.0%，且可在增強(qiáng)紫素的抗腫瘤活性的同時(shí)升高胸腺指數(shù)及外周血中紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白水平。睿臻可延長Lewis肺癌小鼠的生存時(shí)間。睿臻可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549和NCI-H460發(fā)生凋亡。在96.0μg/mL和192.0μg/mL劑量下，可顯著抑制肺癌細(xì)胞穿過重組基底膜的數(shù)量。Westernblot結(jié)果顯示睿臻可抑制Raf/MEK/ERK、FAK/p38等信號(hào)通路。結(jié)論：睿臻在體內(nèi)外均具有一定的抗肺癌活性，其作用機(jī)制可能與阻斷Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，有望開發(fā)成為肺癌治療的天然藥物制劑。

關(guān)鍵詞 睿臻；肺癌；增殖；凋亡；侵襲；增效減毒；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

AbstractObjective：Toinvestigatetheanti-tumoreffectandmechanismsofRuiZhenwhichcontainshawthorn，hippophae，medlar，cordycepin，cordycepspolysaccharide，β-glucanandlycopeneon.Methods：MTTassaywasusedtoanalyzeanti-proliferationactivityofRuiZheninvitro.Anti-tumoractivityandtheeffectofsurvivaltimewereobservedbymouseLewisxenograftmodelinvivo.TheeffectofRuiZhenonapoptosiswasmeasuredbyFCManalysis.WesternblotwasperformedtoinvestigatetheexpressionlevelofproteinsintumortissuestreatedwithRuiZhen.Results：RuiZhenhasagoodproliferationinhibitoryactivityonlungcancercells.TheIC50valuesofA549cellline，NCI-H460celllineandNCI-H1975celllineafter120hwere98.42μg/mL，60.02μg/mLand60.41μg/mLrespectively.RuiZhencanalsosignificantlyinhibitthegrowthofLewislungcancerinmice，andthegrowthinhibitionrateof9.0g/kgrutheniumonLewislungcancerinmicewas70.0%，anditcanenhancethepurplepigment.Theanti-tumoractivityincreasedboththethymusindexandthenumberofredbloodcellsandhemoglobinintheperipheralblood.RuiZhencanprolongthesurvivaltimeofLewislungcancermice.RuiZhencaninduceapoptosisoflungcancercellsA549andNCI-H460.At96.0μg/mLand192.0μg/mL，thenumberoflungcancercellspassingthroughthereconstitutedbasementmembranewassignificantlyinhibited.WesternblotresultsshowedthatrutheniumcaninhibitRaf/MEK/ERK，F(xiàn)AK/p38andothersignalingpathways.Conclusion：RuiZhenhascertainanti-lungcanceractivityinvitroandinvivo，anditsmechanismmayberelatedtoblockingRaf/MEK/ERKsignaltransductionpathway.Itisexpectedtodevelopintoanaturalpharmaceuticalpreparationforlungcancertreatment.

KeyWordsRuiZhen；Lungcancer；Proliferation；Apoptosis；Invading；Efficacyenhancingandtoxicityreducing；Raf/MEK/ERK；FAK/p38

中圖分類號(hào)：R284；R734.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.06.049

癌癥是當(dāng)前世界對(duì)人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率已躍居各類疾病的前列。肺癌為我國癌癥發(fā)病率、死亡率第1位，2017中國癌癥最新數(shù)據(jù)顯示，我國平均每分鐘就有7個(gè)人患癌癥[1]。2013年我國肺癌發(fā)病人數(shù)占全球惡性腫瘤死亡人數(shù)的35.78%，死亡人數(shù)占全球的37.55%[2]?；瘜W(xué)治療仍是肺癌患者常用的治療方式，雖然目前有針對(duì)EGFR、ALK等靶點(diǎn)的化療藥物用于肺癌治療，但由于其耐藥和不良反應(yīng)的產(chǎn)生，化療藥物對(duì)肺癌的臨床治療效果不理想。在中醫(yī)藥治療腫瘤方面，中藥可以通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)具有不良反應(yīng)少、機(jī)體耐受性好等優(yōu)勢(shì)。我國采用中藥聯(lián)合化學(xué)藥物治療晚期惡性腫瘤具有悠久的臨床歷史，目前該治療方式已成為臨床常用的方法[3-4]。天然藥物中存在許多具有抗癌活性的物質(zhì)。睿臻是以山楂、沙棘和枸杞三味中藥為主，并添加蟲草素、蟲草多糖、β-葡聚糖和番茄紅素等制備而成的天然藥物組方，此復(fù)方的抗腫瘤作用未見報(bào)道。本研究主要利用腫瘤細(xì)胞及小鼠移植瘤模型評(píng)價(jià)睿臻的體內(nèi)外抗腫瘤活性，并對(duì)其生物學(xué)功效及作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，人髓母細(xì)胞瘤Daoy，人肺癌細(xì)胞株A549、NCI-H460和NCI-H1975，人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U-87MG購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；人腎癌細(xì)胞株Caki-1由TehBinTean（DUKE-NUSMedicalSchoolSingapore）饋贈(zèng)；人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株T98G購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.1.2動(dòng)物雄性C57BL/6小鼠，體重16.0～18.0g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（合格證號(hào)：SCXK（京）2014-0004）。

1.1.3藥物睿臻為棕黃色粉末，由青海睿元藥物研究所有限責(zé)任公司提供；紫素（Taxol，北京協(xié)和藥廠，批號(hào)：151107）；順鉑（Cisplatin，DDP，上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：15663-27-1）；索拉非尼（Sorafenib，上海蓓瑯生物科技有限公司，批號(hào)：284461-73-0）；吉西他濱（Gemcitabine，武漢東康源科技有限公司，批號(hào)：95058-81-4）；吉非替尼（Iressa）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所馮志強(qiáng)研究員課題組提供。

1.1.4試劑與儀器青霉素鈉鹽及硫酸鏈霉素由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基均購自Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司，胰蛋白酶購自北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所，胎牛血清購自北京元享圣馬生物技術(shù)研究所。牛血清白蛋白第五組分（BSA）購自美國Amresco公司。十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨、聚丙烯酰胺、焦碳酸二乙酯、瓊脂糖、甘氨酸均購自美國Sigma公司。Transwell小室購置美國Corning公司。蘇木精-伊紅（HE）染色液購自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司。乙二胺四乙酸鈉（EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）、無水甲醇、異丙醇由北京化工廠生產(chǎn)。溴化四氮唑藍(lán)（MTT）、RIPA組織/細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Tween-20及溴酚蘭由北京索萊寶科技有限公司提供。甲叉雙丙烯酰胺（N，N′-Methylen-bis-Acrylamide）購自Fluka公司。ECL超敏顯色劑購自北京普利萊公司。抗體均購于美國CellSignalingTechnology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。體外實(shí)驗(yàn)均用二甲基亞砜（DMSO）配制，并用DMSO作為溶劑對(duì)照，終濃度不超過0.1%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)睿臻用雙蒸水溶解，陽性藥（Taxol和DDP）用生理鹽水配制。MEK-6318K血球計(jì)數(shù)儀購自北京瑞博賽工貿(mào)有限公司；C6流式細(xì)胞儀購自ACCURI公司；BioTek96孔單功能發(fā)光檢測(cè)器購自美國PROMEGA公司，IX70倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司，生物分子成像儀LAS4000購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備無菌條件下，剝離傳代于小鼠腋下的Lewis肺癌腫瘤，去除筋膜，剪碎，研磨，用無菌生理鹽水按1∶3比例稀釋后制成濃度為5×107個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠腋下接種0.2mL瘤液。接種后次日動(dòng)物隨機(jī)分組，稱重[6]。在小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物共分8組，分別為正常對(duì)照組（未荷瘤）和溶劑對(duì)照組，陽性藥Taxol給藥組，睿臻給藥組3個(gè)（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg），聯(lián)合給藥組2個(gè)，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分別與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分5組，分別為溶劑對(duì)照組，陽性藥組，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），睿臻3個(gè)劑量組，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg。

1.2.2給藥方法1）在小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組（未荷瘤）和溶劑對(duì)照組，每天灌胃雙蒸水，0.4mL/20g，2次/d；陽性藥Taxol給藥組，15.0mg/kg，腹腔注射，0.2mL/20g，1次/3d，共給藥3次；睿臻給藥組3個(gè)（2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg）灌胃，0.4mL/20g，2次/d；聯(lián)合給藥組2個(gè)，2.25g/kg、4.5g/kg睿臻分別與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合；睿臻接種前給藥5d，接種后給藥9d。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，溶劑對(duì)照組，0.4mL/20g，2次/d，灌胃；陽性藥組，DDP（5mg/kg）+Taxol（20mg/kg），腹腔注射，0.2mL/20g，1次/周，共給藥4次；睿臻3個(gè)劑量組，2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg，灌胃，0.4mL/20g，2次/d，共給藥29d；溶劑對(duì)照組給予等體積蒸餾水。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞存活率：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為1.5×104細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，按1500個(gè)/孔接種于96孔板，每孔100μL。次日加入不同濃度睿臻及相應(yīng)溶劑對(duì)照的新鮮培養(yǎng)基，每孔加入100μL（DMSO終濃度<0.1%）。樣品設(shè)3～6個(gè)劑量組，每組設(shè)3個(gè)平行孔。于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)120h后，棄上清液，每孔加入新鮮配制的含0.5mg/mLMTT的無血清培養(yǎng)基100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清液，每孔加入200μLDMSO溶解甲臜沉淀，微型振蕩器振蕩混勻后，檢測(cè)波長570nm條件下測(cè)定吸光度值（A570）[5]，以溶劑處理的腫瘤細(xì)胞為溶劑對(duì)照組，按下列公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按照中效方程計(jì)算IC50。抑制率（%）=（A570溶劑對(duì)照組-A570給藥組）/A570溶劑對(duì)照組×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2）小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束，眼眶取血檢測(cè)血細(xì)胞個(gè)數(shù)，處死動(dòng)物，稱體重，剝?nèi)⌒叵偌澳[瘤組織、稱重。根據(jù)重量計(jì)算胸腺指數(shù)，腫瘤抑制率（%），用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行各給藥組與陰性對(duì)照組之間的t檢驗(yàn)。小鼠Lewis肺癌移植瘤部分腫瘤組織于-80℃冰箱保存用于后續(xù)機(jī)制研究。

在小鼠Lewis肺癌生命延長實(shí)驗(yàn)中，每周稱2次體重及腫瘤體積，每天記錄動(dòng)物存活只數(shù)，根據(jù)腫瘤體積計(jì)算腫瘤抑制率（%），用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并進(jìn)行各給藥組與陰性對(duì)照組之間的t檢驗(yàn)。

3）重組基質(zhì)膜侵襲運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的聚偏氟乙烯（PVPF）膜外表面涂10μLFibronectin（0.5μg/μL），置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。在膜的內(nèi)面涂10μLMatrigel（0.5μg/μL），超凈臺(tái)內(nèi)吹干備用。在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加入10%FBS-DMEM，每孔600μL。用1mmol/LEDTA收集對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，懸浮于含0.1%BSA-DMEM培養(yǎng)基中，終濃度為2×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加到Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室中，每小室200μL。將小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2溫箱內(nèi)孵育18h。將Transwell取出，濾膜用甲醇固定10min，蘇木精-伊紅（HE）染色，水洗，用棉簽擦掉未穿過膜的細(xì)胞，用二甲苯透明后將膜封于載玻片上，于400倍顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)上中下左右5個(gè)不同視野的透過細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，每組平行設(shè)3孔。以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。抑制率（%）=（對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)-給藥組侵襲細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

4）流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布及凋亡情況：睿臻處理肺癌細(xì)胞72h后，將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2遍，胰蛋白酶-EDTA消化，以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。4℃，800r/min離心5min收集細(xì)胞，以PBS重懸，鏡下計(jì)數(shù)后，取2×106個(gè)細(xì)胞，將其置于70%乙醇中于-20℃凍存24h以上，之后于4℃，800r/min離心5min，徹底去除乙醇。PBS洗2遍并懸浮之，加入PI染液（0.1mg/mLPI，0.02mg/mLRNaseA，1mg/mL檸檬酸鈉和0.3%TritonX-100），搖勻后于37℃避光放置0.5h，經(jīng)300目篩過濾，在ACCURIC6流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡情況。

5）WesternBlot檢測(cè)分析蛋白表達(dá)：取小鼠Lewis肺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)中-80℃冰箱保存的3組（荷瘤溶劑對(duì)照組，睿臻4.5g/kg、9.0g/kg）瘤組織，每組3只研磨，組織裂解液冰上裂解1h，12000r/min離心30min，提取總蛋白，于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩２捎肂CA法，以一定濃度梯度的BSA溶液為標(biāo)準(zhǔn)，于570nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)測(cè)定樣品的吸光度值，計(jì)算蛋白水平，之后用組織裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白電轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)[5]。將PVDF膜以含有5%脫脂奶粉的TTBS（0.1%Tween-20，10mmol/LTris-HCl，pH7.5，150mmol/LNaCl）室溫封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)2h。將膜與稀釋的指定的一抗4℃孵育過夜，TTBS液洗膜3次。將膜移入二抗工作液（用TTBS液按1∶5000稀釋HRP標(biāo)記的二抗），室溫反應(yīng)1h。TTBS液洗膜3次，加入化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液，ECL照相系統(tǒng)照相[5-6]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1睿臻對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用采用MTT法檢測(cè)睿臻對(duì)腫瘤細(xì)胞作用120h后的增殖抑制作用。睿臻的MTT結(jié)果顯示，睿臻對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞株、腎癌細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的增殖均有一定的抑制作用。其中，睿臻對(duì)肺癌細(xì)胞株的生長抑制作用最為明顯，對(duì)A549細(xì)胞株、NCI-H460細(xì)胞株和NCI-H1975細(xì)胞株的IC50值分別為（98.42±1.21）μg/mL、（60.02±1.77）μg/mL和（60.41±2.56）μg/mL，在后續(xù)研究中選擇肺癌繼續(xù)進(jìn)行生物學(xué)功能的研究及機(jī)制探討。見表1。

2.2睿臻對(duì)小鼠移植瘤Lewis肺癌的生長及中位生存期的影響

采用小鼠Lewis肺癌移植瘤模型進(jìn)一步考察睿臻的體內(nèi)抗腫瘤作用。睿臻可劑量依賴性抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長，與溶劑對(duì)照組比較，睿臻2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg3個(gè)劑量的抑制率分別為33.8%、39.9%和70.00%（P<0.001）。睿臻不僅可以抑制小鼠Lewis肺癌的生長，還可延長Lewis肺癌荷瘤小鼠的中位生存期。如表3所示，與溶劑對(duì)照組比較，陽性藥組對(duì)降低荷瘤小鼠的中位生存期，為21d；而睿臻4.5g/kg和9.0g/kg劑量組均可明顯延長荷瘤鼠的中位生存期，其分別為26d和27d，而溶劑對(duì)照組中位生存期為24.7d。在本實(shí)驗(yàn)中，溶劑對(duì)照組荷瘤小鼠在接種第10天，腫瘤體積為（1998.71±356.30）mm3；而在睿臻9.0g/kg劑量組中，腫瘤體積為（749.35±355.05）mm3，抑制率達(dá)到62.51%（P<0.001），提示睿臻在抑制小鼠肺癌生長的同時(shí)可延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。見表2，圖1。

在小鼠Lewis肺癌移植瘤模型中，睿臻不僅對(duì)腫瘤生長具有較強(qiáng)的抑制作用，還可增強(qiáng)Taxol的抗腫瘤活性。與溶劑對(duì)照組比較，15.0mg/kgTaxol對(duì)小鼠Lewis肺癌生長的抑制率為43.4%（P<0.001）；灌胃給予2.5g/kg、4.5g/kg睿臻對(duì)小鼠Lewis肺癌的生長抑制率分別為33.8%和39.9%（P<0.001），而當(dāng)與15.0mg/kgTaxol聯(lián)合應(yīng)用時(shí)抑制率可分別達(dá)到55.8%（P>0.05，與單獨(dú)使用Taxol組比較）和58.0%（P<0.05，與單獨(dú)使用Taxol組比較），提示睿臻與Taxol具有協(xié)同效應(yīng)。見表2，圖1。

胸腺是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場(chǎng)所，其功能與免疫緊密相關(guān)，胸腺指數(shù)可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。本研究通過比較各組動(dòng)物間的胸腺指數(shù)以考察睿臻對(duì)荷瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。與正常小鼠比較，荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)明顯降低（P<0.05）；與溶劑對(duì)照組比較，睿臻在4.5g/kg和9.0g/kg劑量下，可升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)。陽性藥Taxol給藥組可引起荷瘤小鼠胸腺指數(shù)的進(jìn)一步降低（P<0.05，與溶劑對(duì)照組比較）。當(dāng)4.5g/kg睿臻與Taxol聯(lián)合使用時(shí)，與陽性藥Taxol給藥組比較，荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)明顯升高（P<0.05）。因此推測(cè)睿臻可以改善Taxol對(duì)荷瘤小鼠所造成的免疫功能抑制。見圖2。

為了初步觀察睿臻在治療中的不良反應(yīng)，本研究觀察了單獨(dú)使用睿臻及與Taxol聯(lián)合使用時(shí)對(duì)Lewis肺癌小鼠外周血計(jì)數(shù)的影響。與正常小鼠比較，荷瘤小鼠外周血中的白細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.001），而紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白水平顯著降低（P<0.001）；陽性藥Taxol可降低荷瘤小鼠外周血中的血紅蛋白水平，對(duì)紅細(xì)胞數(shù)量無明顯影響（P>0.05）。與溶劑對(duì)照組比較，睿臻各劑量組均可升高外周血中的紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白水平；此結(jié)果提示，睿臻對(duì)荷瘤小鼠外周血無明顯的不良反應(yīng)，且可升高化療后的紅細(xì)胞及血紅蛋白數(shù)量。見表4。

2.3睿臻對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證睿臻對(duì)肺癌細(xì)胞的作用，本文采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)睿臻對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響。睿臻處理A549和NCI-H460細(xì)胞72h后，凋亡細(xì)胞數(shù)劑量依賴性增加。在A549細(xì)胞中，在48.0μg/mL和96.0μg/mL劑量下，凋亡細(xì)胞所占比例分別為（20.37±4.40）%和（31.17±2.25）%，而溶劑對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例為（12.93±2.00）%。在NCI-H460細(xì)胞中，當(dāng)睿臻劑量為60.0μg/mL，120.0μg/mL時(shí)，可分別引起（14.00±2.69）%和（31.27±8.83）%的細(xì)胞凋亡，對(duì)照組凋亡率僅為（7.23±2.31）%。上述結(jié)果表明，睿臻可有效地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。見圖3。

2.4睿臻對(duì)A549和NCI-H460細(xì)胞侵襲能力的影響

采用重組基質(zhì)膜侵襲實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，在96.0μg/mL和192.0μg/mL劑量下，睿臻可顯著減少A549細(xì)胞和NCI-H460細(xì)胞穿過重組基底膜的數(shù)量。在A549細(xì)胞中，對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制率分別為（66.0±1.54）%和（80.2±3.59）%；在NCI-H460細(xì)胞中，抑制率分別為（70.54±1.68）%和（83.5±6.08）%。在250.0μg/mL劑量下，睿臻作用18h對(duì)A549和NCI-H460細(xì)胞的生長抑制率僅為（13.00±2.22）%和（11.89±14.60）%，而侵襲實(shí)驗(yàn)中選用最大濃度為192.0μg/mL，說明睿臻抑制A549和NCI-H460細(xì)胞侵襲的活性可能不是由抑制細(xì)胞生長造成的。見圖4。

2.5睿臻對(duì)小鼠Lewis肺癌組織內(nèi)蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞增殖的失控和細(xì)胞凋亡的抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要基礎(chǔ)。這兩者共同引起體內(nèi)細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的破壞[7]。上述研究結(jié)果表明，睿臻可明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，為探討其作用機(jī)制，采用WesternBlot方法檢測(cè)藥物對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。文獻(xiàn)報(bào)道，c-Raf介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖和存活，且在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[8-11]，因此我們首先檢測(cè)了睿臻對(duì)c-Raf相關(guān)蛋白活性的影響。睿臻可顯著抑制Lewis肺癌組織內(nèi)p-c-Raf（Ser289）、p-MEK和p-ERK1/2的蛋白表達(dá)，在4.5g/kg劑量下對(duì)MEK和ERK的總水平并無顯著影響，但在9.0g/kg劑量下略降低兩者的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)睿臻對(duì)肺癌組織內(nèi)p53、c-caspase3和c-PARP等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[12-15]。本研究結(jié)果顯示，睿臻可顯著上調(diào)p53、c-caspase3和c-PARP的水平。提示睿臻可能通過阻滯Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制肺癌細(xì)胞增殖。見圖5。

FAK/p38信號(hào)通路與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[16-17]，為此進(jìn)一步檢測(cè)了睿臻作用后肺癌組織內(nèi)FAK/p38信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，睿臻能顯著降低p-FAK（Tyr397）、p-p38MAPK和MMP2的表達(dá)，但在9.0g/kg劑量下，對(duì)FAK的總水平有明顯的抑制作用，而對(duì)p38MAPK的總水平無顯著影響。因此，我們初步推測(cè)睿臻抑制肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力可能與其對(duì)FAK/p38信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)。

3討論

肺癌具有發(fā)病率高、死亡率高，易轉(zhuǎn)移3大特點(diǎn)，且臨床治療難度大[18]。目前，化學(xué)治療仍然是治療晚期肺癌常用的治療手段，但由于化療易引起機(jī)體耐藥及較嚴(yán)重的不良反應(yīng)[3-4，19-21]，因此尋找安全有效治療肺癌的方法和藥物是各國科學(xué)家研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。中藥具有多靶標(biāo)的特點(diǎn)，在治療上通常會(huì)產(chǎn)生藥效疊加，毒性分散的效果[3，16，19]，所以預(yù)期中藥復(fù)方會(huì)對(duì)癌癥起到較好的治療及輔助治療的作用。山楂中含有山楂酸、果皮多酚及果肉多酚等多種抗癌物質(zhì)[22-23]。沙棘不但在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)還在抗癌抑瘤方面療效顯著[24]。枸杞多糖是枸杞中的主要成分，能夠抑制多種腫瘤的生長，提高機(jī)體免疫力[25-26]。蟲草素對(duì)肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞生長增殖均具有抑制作用[27]。因此研究以上述成分為主的天然藥物組方——睿臻的抗肺癌作用及其機(jī)制研究具有重要的意義，且該組方的抗肺癌作用國內(nèi)外未見報(bào)道。

本研究中發(fā)現(xiàn)睿臻對(duì)A549、NCI-H460和NCI-H1975肺癌細(xì)胞株具有較好的體外抑制活性，進(jìn)一步體內(nèi)研究結(jié)果表明其可抑制小鼠Lewis肺癌的生長，延長荷瘤鼠的中位生存期。目前，Taxol為主要的肺癌化療藥物，睿臻可增加Taxol的抗腫瘤活性，同時(shí)可升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)，升高Taxol降低的胸腺指數(shù)，推測(cè)睿臻可通過調(diào)節(jié)荷瘤鼠的免疫功能進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤作用，且睿臻可能對(duì)Taxol造成的免疫抑制有一定的緩解作用。睿臻對(duì)荷瘤小鼠的外周血無明顯不良影響，與化療藥物Taxol聯(lián)合使用可以增加荷瘤鼠外周血中紅細(xì)胞和血紅蛋白的數(shù)量，提示睿臻有可能對(duì)化療藥物造成的造血功能損傷起到一定的緩解作用，因此睿臻與化療藥Taxol聯(lián)用具有增效減毒的作用，為臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

睿臻可降低Lewis肺癌組織內(nèi)c-Raf的磷酸化水平，導(dǎo)致MEK磷酸化及下游信號(hào)通路的顯著抑制，表現(xiàn)為ERK磷酸化水平的明顯下降，進(jìn)而促進(jìn)p53、c-caspase3和c-PARP的表達(dá)。Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡；在Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的作用下，細(xì)胞內(nèi)c-caspase-3、c-PARP表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞凋亡受到抑制。因此，睿臻可能是通過抑制肺癌組織內(nèi)c-Raf的磷酸化水平，進(jìn)而抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。睿臻可降低肺癌組織內(nèi)p-FAK（Tyr397）的水平，進(jìn)而抑制p38MAPK磷酸化及下游信號(hào)通路蛋白MMP2等的表達(dá)。轉(zhuǎn)移是肺癌致死的主要原因，這是臨床上治療肺癌的難點(diǎn)，也是肺癌研究的熱點(diǎn)[21，28]。已有研究表明FAK/p38信號(hào)通路參與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程[16-17]，因此推測(cè)睿臻抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移的作用有可能與抑制FAK/p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

本研究結(jié)果初步證明，睿臻可通過阻滯Raf/MEK/ERK和FAK/p38信號(hào)通路，發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的作用。在顯著抑制腫瘤生長的同時(shí)，睿臻對(duì)荷瘤小鼠的免疫功能及造血功能亦有一定的保護(hù)作用。睿臻在抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)面表現(xiàn)出較好的效果和廣闊的應(yīng)用前景，其抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究，期望經(jīng)過我們的努力，睿臻能夠開發(fā)成為抗腫瘤的復(fù)方制劑，造福廣大腫瘤患者。

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（2018-03-28收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）