董文煥　祝妍瑾　陳文榮

摘 要 對中學生物教材中涉及到的植物類實驗材料所使用的經典的染色劑，如碘液、斐林試劑、蘇丹III染液、吡羅紅甲基綠染色劑、龍膽紫染液和健那綠染液等，進行了歸納總結，旨在為教材中所涉及的植物類實驗中的染色劑的應用及優(yōu)化提供一些研究和思考的方向。

關鍵詞 中學生物 染色劑 應用 優(yōu)化

中圖分類號 G633.91 文獻標志碼 B

中學生物學教材中包含了許多探究性、驗證性和設計類實驗等，其中許多植物類實驗中涉及到組織、細胞染色劑，而且不少教材上的染色方法存在著效果不理想等問題。下面通過文獻綜述并結合實驗室的實踐，對中學階段植物類實驗的染色劑及使用方法進行總結并對染色方法進行優(yōu)化改進，以提高實驗效果和效率，真正引導學生勤思考、勤動腦，學以致用，進行相應的實驗方法的遷移教育。

1 碘液

碘液是中學生物實驗室最常用的染色劑之一。例如，觀察人的口腔上皮細胞、觀察洋蔥內表皮細胞、觀察酵母菌細胞、觀察玉米種子的結構、探究影響酶活性的條件、探究植物的光合作用以及革蘭氏染色等實驗中都用到碘液。

受到傳統(tǒng)實驗方法和試劑材料的局限，觀察植物表皮細胞這一實驗教學實踐中一直使用碘液進行染色，實驗教學缺少創(chuàng)新，染色效果單一且有些觀察效果不佳。筆者以洋蔥鱗片葉表皮為材料進行了大量的實驗，建議從有機試劑（如堿性品紅、亞甲基藍、固綠、蘇木精等）和無機染料[如體積分數為24.5%H2SO4、飽和Fe2（SO4）3溶液、飽和CuSO4溶液、物質量濃度為0.5 mol/L的Li2SO4溶液等]進行單染色和交互染色，以取得更好的染色效果，以求豐富植物細胞染色色系，并為中學實驗教學提供更多的染色方法及更為豐富的染色效果。

碘液在中學生物實驗中，還廣泛用于淀粉的鑒定。在該實驗中，取2 mL含淀粉的生物組織勻漿的上清液，加入2～3滴碘—碘化鉀溶液，可以將該樣品染成藍色，原理是淀粉遇碘變藍色。需要注意的是若使用其他富含淀粉的材料進行實驗時，有的材料遇淀粉不顯藍色，而顯紫色，也是正?，F象，這是由于實驗材料中的支鏈淀粉與碘液發(fā)生了紫色的顯色反應。

在驗證酶的專一性的實驗中，常用淀粉酶來催化淀粉水解，而對實驗結果的驗證都采用淀粉遇碘變藍這一顏色反應。一般是將一定量可溶性淀粉溶液加入試管，調至實驗所需的溫度和pH條件下，加入淀粉酶，保溫5～10 min，最后向試管中滴加碘液。關于碘液的滴加順序，有學者提出了不同的觀點。曹志強做了驗證試驗，并提出了“先加碘液效果更好”的觀點，認為其現象明顯，能觀察到反應前與反應后顏色變化情況，更增強了對比效果。但田久沛等人經過研究對其進行了糾正，認為在進行淀粉酶的性質實驗時，碘液應最后加入，而不能在加入淀粉酶之前加入。其理由如下：一方面，若提前加入，一方面會由于I2的氧化性而使淀粉酶性質發(fā)生改變；另一方面，碘與淀粉生成的藍色復合物在加熱時會消失，影響對淀粉水解進程的判斷。若混合液體的溫度較高，還應取出試管，待冷卻后再加入碘液，防止碘在較高溫度下升華。

2 斐林試劑

斐林試劑是由物質量濃度為0.1 g/mL的NaOH溶液（甲液）和0.05 g/mL的CuSO4溶液（乙液）組成的，與可溶性還原糖（葡萄糖、果糖和麥芽糖）在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。但是要注意斐林試劑的甲、乙液要單獨配置和貯存且混合后應立即使用，特別在室溫高于35℃的環(huán)境中，堿性新制氫氧化銅懸濁液中的Cu（OH）2將在較短時間內分解成黑色CuO沉淀從而影響還原糖的檢測。

針對鑒定還原糖實驗中，斐林試劑的甲、乙溶液是否要混合均勻后才能注入這一問題，有不少研究對此進行了研究探討。韓萍為此進行了實驗設計，結果發(fā)現甲、乙液混合與不混合差別不是很大，都為磚紅色，憑肉眼根本無法區(qū)分，因此，她認為在實驗過程中甲、乙液的加入順序無嚴格要求。郭衛(wèi)華對其進行了改進，提出斐林試劑的使用順序對實驗結果有一定影響，但都能出現磚紅色沉淀，可能是待測液中的有機酸會中和一些NaOH，使產生的Cu（OH）2不足，所以先加甲液，后加乙液的試管中磚紅色沉淀會少些。

在還原糖的鑒定中，本尼迪特試劑對斐林試劑進行改良而得到被廣泛用來替代斐林試劑。經驗證，在染色效果上有很好的優(yōu)勢。理論上甘油銅也可替代斐林試劑，還有待進一步的證實和研究。

3 蘇丹染液

蘇丹染液是一種脂溶性染料，它和脂質有比較強的親和力，所以當含有脂肪的標本與蘇丹染液接觸時，蘇丹染料便從染液中轉移到含脂肪的結構中，使脂肪顯色。脂肪能被蘇丹Ⅲ染液染成橘黃色。用蘇丹染料鑒定脂肪時，實驗所用花生種子材料，必須提前3～4 h浸泡。浸泡時間過短，不易切成薄片；浸泡時間過長，組織太軟，切下的薄片又不易成形。但是在實際的操作中，徒手切片對于中學生來說有很大的難度，切除的切片往往厚薄不一，導致在鏡下觀察不到被染成橘黃色的脂肪顆粒。經過文獻閱讀以及實驗和驗證，筆者發(fā)現撕片法、模仿血涂片法、敲擊壓片法、花生泥法、酒精燈加熱摩擦法均可以取得良好的效果，且蘇丹Ⅳ染液染色效果優(yōu)于蘇丹Ⅲ染液。

在脂類物質的鑒定中，也可以從染色劑方面加以改善，建議使用蘇丹Ⅳ染液，脂肪遇蘇丹Ⅳ變?yōu)殚偌t色。理論上蘇丹黑染液或油紅O染液也可以替代蘇丹Ⅲ染液。蘇丹黑是一種脂溶性染料，可溶解于細胞漿內的含脂結構中，使胞漿中的脂類物質呈棕黑色或深黑色顆粒；油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結合呈小脂滴狀，使組織內的脂滴呈橘紅色。

4 吡羅紅甲基綠染色劑

吡羅紅-甲基綠染色劑在人教版高中生物《必修1·分子與細胞》中“觀察DNA和RNA在細胞中的分布”的實驗中發(fā)揮著極其重要的作用，使用該染料時應注意要現配現用。由于DNA主要分布在細胞核內，RNA大部分存在于細胞質中，堿性染料甲基綠、吡羅紅對DNA和RNA的親和力不同，甲基綠使DNA呈現綠色，而吡羅紅使RNA呈現紅色。所以利用甲基綠-吡羅紅混合染色劑將細胞染色，可以顯示DNA和RNA在細胞中的分布。

在實驗材料上，教材中介紹了人的口腔上皮細胞，此外也提出了可用其他動物或植物細胞代替，大多數有關研究都提倡采用洋蔥內表皮細胞代替口腔上皮細胞。在染液配方上，有以下兩種改進方案：李曉聰對A液的配制進行了改進，由教材中的取吡羅紅-甲基綠粉1 g進行溶解，改為取甲基綠2 g、吡羅紅5 g分別進行溶解后再混合的方案，并通過大量的重復試驗進一步探索了染液濃度對實驗的影響，結果證明將配制的染液稀釋到原濃度的1/6時，實驗效果較穩(wěn)定，重復性好；吳志強則先用氯仿對甲基綠提純3～4次再進行配置，通過多次調試與對比實驗發(fā)現，質量分數為1.5%的甲基綠和2%的吡羅紅以5∶1的比例混合配置所形成的染色劑染色效果最好，且能在棕色瓶中密封保存一周。

5 龍膽紫溶液

染色體容易被堿性或酸性染液著色，龍膽紫是一種混合的堿性染料可以將染色體（質）染成深藍色，因此可以作為檢測染色體的物質。“觀察植物根尖組織細胞的有絲分裂”是中學生物中難于操作又易失敗的實驗，其中龍膽紫染色要注意時間的把握，不宜太長或太短，否則會導致很難看清細胞中染色體的變化情況，都會影響實驗效果。關于染色液的濃度有不少學者提出了改進，大致有以下兩種方案：質量分數為0.3%龍膽紫液染色3～5 min，或質量分數為1%龍膽紫液染色1 min。也有研究驗證，龍膽紫染液按照染色對象有不同的配制方法，效果更好。

除了用龍膽紫溶液外，也可以用醋酸洋紅溶液、Schiff試劑、Giemsa染液或改良苯酚品紅溶液來替代龍膽紫溶液。在日常實驗教學中，如果僅作臨時裝片來觀察，可以采用孚爾根染色、呂氏堿性藍染色法、番紅染色法、結晶紫或龍膽紫染色法、醋酸洋紅染色法、番紅染色法。而要制作永久裝片，區(qū)分比較細胞有絲分裂和減數分裂各個時期和染色體組型分析，建議采用改良苯酚品紅染色法或 Giemsa染色法。

6 健那綠染液

健那綠B是專一性染線粒體的活體染料，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使健那綠B染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)）呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中的健那綠B則被還原，呈現無色的狀態(tài)。

教材中建議制作人口腔上皮細胞臨時裝片來觀察線粒體，但取材過程要求較高，有時可能觀察不到細胞。大多數學者建議采用洋蔥內表皮細胞作為實驗材料，洋蔥細胞活性比較強，線粒體數量多，易觀察。其次，取材時從洋蔥內部（之前不切開）取無色透明內表皮，少有細菌干擾。也有研究認為大白菜是代替口腔上皮細胞最理想的植物材料，蔥次之。教材中健那綠染液的配法，染料往往溶解不夠完全，染色完成后常有不少的染料顆粒沉積于標本上，影響實驗觀察。因此建議將配制質量分數為1%的健那綠B溶液用濾紙過濾，作為原液；臨用前用生理鹽水稀釋50倍用于實驗。這樣既減少染料顆粒的形成，又節(jié)約實驗成本。目前，有實踐進一步證明質量分數在0.4%～0.8%之間時染色效果最佳。

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