高建德，師婷婷，范凌云，劉 雄

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

枸杞是茄科植物枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實，始載于2000多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》并被列為上品，同時又是國家衛(wèi)生部公布的藥食同源品種，具有補(bǔ)肝腎、益精血、明目之功效。大量研究［1-2］表明，枸杞中含有的多糖類物質(zhì)為其發(fā)揮功效的主要物質(zhì)之一，具有增強(qiáng)免疫力、抗癌、抗氧化、防衰老、增加造血功能、防止遺傳損傷和細(xì)胞突變等作用。因此，提取枸杞多糖、提高枸杞多糖的提取率對開發(fā)枸杞資源具有重要意義。目前有關(guān)枸杞多糖的提取主要有水浸法、堿液提取法、超聲波萃取法、微波法、酶解提取法等［3-4］。但水浸法提取周期長，提取率低，需要多次重復(fù)浸泡提取才能提高產(chǎn)率，且提取的多糖純度不高［5］；堿液提取后液體需要中和，后期處理繁瑣，容易使部分多糖發(fā)生水解，破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)、減少多糖得率［6］。超聲波萃取法和微波法雖能提高枸杞多糖提取率，但耗能大，成本高。而酶輔助提取條件溫和，提取時間短、能耗低、成本低廉，有利于保持有效成分原有的藥效，因此，酶輔助提取可作為一種新技術(shù)為中藥提取提供新途徑［7］。有關(guān)枸杞多糖的酶輔助提取雖已有文獻(xiàn)報道［8-9］，但有關(guān)木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖的文獻(xiàn)鮮見報道。

目前測量多糖含量文獻(xiàn)報道的方法主要有蒽酮硫酸法和苯酚硫酸法，其中苯酚硫酸法測定的實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性優(yōu)于蒽酮硫酸法，故測定多糖含量更多應(yīng)用苯酚硫酸法，但苯酚硫酸法存在數(shù)據(jù)波動較大，重復(fù)性差等缺點［10］。因此，對苯酚硫酸法進(jìn)行改進(jìn)，以提高該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性顯得較為重要。改良差示酚硫法是對苯酚硫酸法的改進(jìn)，可用于含有雜質(zhì)的多糖樣品的定量分析，既能簡化多糖樣品預(yù)處理，避免繁瑣操作，減少非糖雜質(zhì)的干擾，又能克服原有方法在顯色反應(yīng)中因濃硫酸放熱而導(dǎo)致的諸多難點，從多方面減少測量誤差，提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和穩(wěn)定性［11］。為此本研究在改良差示酚硫法測定枸杞多糖的基礎(chǔ)上，研究木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖的工藝，為更精準(zhǔn)地測定枸杞多糖及更好地開發(fā)利用枸杞資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UV Blue Star B型紫外-可見分光光度計（LabTech，北京萊佰泰科技有限公司）；DD-5M離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；AL104型電子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；電熱恒溫水浴鍋（浙江省余姚市檢測儀表廠）；AKRYUP-1816超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥 枸杞（購于蘭州市黃河藥材市場，產(chǎn)自寧夏）樣品經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院晉玲教授鑒定為寧夏枸杞；葡萄糖（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200904）；木瓜蛋白酶（購于寧夏和氏壁生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇、石油醚、濃硫酸、苯酚及其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸杞多糖含量測定方法的建立

2.1.1 枸杞粗多糖的制備 精密稱取干燥枸杞藥材20.0g，粉碎至適宜粒度，置于回流裝置中，加8倍量石油醚脫脂2次，2 h/次，回收溶劑，枸杞藥渣真空干燥后加10倍量水煎煮2次，2h/次，水提液濃縮后加乙醇使含醇量達(dá)30%，低溫靜置24小時后離心，上清液加乙醇使含醇量達(dá)85%，靜置離心，取沉淀真空干燥的枸杞粗多糖。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取枸杞粗多糖粉末適量，依次用石油醚、乙醚、乙醇洗滌、離心，真空干燥枸杞粗多糖，得精制的枸杞多糖樣品，再加蒸餾水溶解，制成0.25 mg/mL多糖供試液儲備待用。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取置五氧化二磷真空干燥箱干燥24小時的葡萄糖25 mg，加蒸餾水溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成0.50 mg/mL葡萄糖貯備液，備用。

2.1.4 檢測波長的選擇 取“2.1.2”項下所得多糖供試品溶液1.0 mL置具塞試管中，加入1.0 mL 0.05 g/mL苯酚溶液，混勻，快速滴加5.0 mL 84%的硫酸溶液，振搖2分鐘，置沸水浴加熱30分鐘，取出，流水冷卻至室溫，補(bǔ)加1.0 mL蒸餾水，搖勻后在紫外-可見分光光度計400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，以蒸餾水相同操作作為空白對照，各波長下測得吸光度值A(chǔ)1。另取“2.1.2”項下所得多糖供試品溶液1.0 mL置具塞試管中，加入1.0 mL蒸餾水，混勻，快速滴加5.0mL 84%的硫酸溶液，振搖2分鐘，置沸水浴加熱30分鐘，取出，流水冷卻至室溫，補(bǔ)加1.0 mL 0.05 g/mL的苯酚溶液，搖勻后在紫外-可見分光光度計400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，以蒸餾水相同操作作為空白對照，各波長下測得吸光度值A(chǔ)2。ΔA樣＝A1－A2。取對照品溶液按同樣的方法操作，于400～600nm波長范圍內(nèi)掃描測定各波長下吸光度值A(chǔ)11和A22。ΔA對=A11-A22。以ΔA樣和ΔA對各點做吸收曲線L樣和L對。結(jié)果顯示，L樣和L對在484 nm處均有最大吸收，因此，選擇484 nm進(jìn)行測定。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密吸取“2.1.3”項下葡萄糖對照品溶液，置于具塞試管中，分別加蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度分別為 0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。按“2.1.4”項下方法測定吸光度值A(chǔ)1和A2，計算出對應(yīng)的吸光度差值ΔA（A1-A2），由質(zhì)量濃度C對ΔA進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

結(jié)果表明葡萄糖濃度在0.025～0.3 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度實驗 精密吸取“2.1.2”項下樣品溶液1 mL，按“2.1.4”項下方法操作，平行測定5次，得RSD值為1.83%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性實驗 精密吸取“2.1.2”項下樣品溶液5份，每份1 mL，按“2.1.4”項下方法操作測定吸光度值，得RSD值為2.45%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 回收率實驗 精密吸取同一供試品溶液1 mL，取9份，每3份分別精密加入樣品含多糖量的 80%、100%、120%的葡萄糖對照品，按“2.1.4”項下方法操作測定吸光度值，計算回收率，得平均回收率為 98.76%，RSD 為 2.24%。

2.1.9 樣品測定 按照“2.1.4”項所述方法測定吸光度值，求得ΔA樣，由“2.1.5”項下回歸方程計算樣品液中的單糖質(zhì)量濃度（C），按下式計算枸杞多糖含量。枸杞多糖含量（%）=C·D/W×100%

式中C為樣品最終測定液中單糖質(zhì)量濃度（mg/mL），D為枸杞多糖樣品溶液的稀釋倍數(shù)，W為枸杞樣品質(zhì)量（mg）。

2.2 均勻設(shè)計實驗

2.2.1 均勻設(shè)計與結(jié)果 在酶輔助提取工藝中酶用量、pH、酶解時間及酶解溫度為酶輔助提取必須考察的因素，在選取木瓜蛋白酶的基礎(chǔ)上加均勻?qū)嶒灒瑢λ孛赣昧浚╔1）、pH（X2）、酶解時間（X3）及酶解溫度（X4）4個因素進(jìn)行考察，考察其對枸杞多糖提取率的影響，見表1。

表1 U*7（74）木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖均勻設(shè)計

2.2.2 均勻設(shè)計實驗結(jié)果 利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為：Y=16.455-3.678X1-1.712X2-0.659X3，其中Y為枸杞多糖含量；X1為酶用量；X2為pH值，X3為酶解時間，對回歸方程進(jìn)行檢驗所得復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.983，檢驗值F=113.320，臨界值F（0.05，3，3）=9.28.檢驗值F＞F（0.05，3，3），P＜0.05，說明回歸方程具有顯著性意義。回歸方程中酶用量（X1）、pH（X2）、酶解時間（X3）的回歸方程系數(shù)為負(fù)值且為顯著性影響因素，其取值應(yīng)為極小值；酶解溫度（X4）沒有納入回歸方程，其取值可以為極小值至極大值之間的任意值。根據(jù)回歸方程并結(jié)合專業(yè)知識，確定枸杞多糖木瓜蛋白酶酶解提取的最佳工藝條件為：酶用量為0.2%，pH為4.2，溫度為40℃，酶解時間為1.0小時。將優(yōu)化值代入回歸方程得Y=8.60%。

2.2.3 工藝參數(shù)驗證實驗 精密稱取枸杞藥材3份（20，20，20 g），粉碎至適宜粒度，石油醚脫脂，按優(yōu)選出的最佳提取工藝條件在pH 4.2、木瓜蛋白酶用量0.2%、酶解時間1.0小時、酶解溫度40℃的條件下進(jìn)行酶解提取，測定枸杞多糖的含量，不加酶作為空白對照，結(jié)果見表2。

表2 工藝參數(shù)驗證結(jié)果

從表2可以看出，按優(yōu)化工藝進(jìn)行驗證實驗，枸杞多糖提取率平均值為8.50%，與均勻設(shè)計實驗預(yù)測結(jié)果（8.60%）基本接近，并且與傳統(tǒng)枸杞水煎（4.77%）相比，木瓜蛋白酶輔助提取能明顯提高枸杞多糖提取率。

2.3 木瓜蛋白酶輔助酶解提取液相對黏度分析 相對黏度的測定按《中國藥典》2015版二部附錄VIG中烏氏黏度計測定相對黏度方法進(jìn)行測定。取不同濃縮比例的枸杞粗多糖提取液一定量置烏氏黏度計內(nèi)，將黏度計垂直固定于25℃恒溫水槽中，使枸杞多糖提取液溫度與水浴溫度達(dá)到平衡，保溫25分鐘。記錄枸杞多糖提取液在烏氏黏度計中的流出時間（t），并以蒸餾水作為對照，記錄蒸餾水在烏氏黏度計中流出的時間（t0），運(yùn)用相對黏度（E0）公式E0=t/t0計算枸杞多糖提取液的E0，分析比較傳統(tǒng)水煎提取與酶解輔助水提枸杞多糖提取液不同濃縮比的相對黏度。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶解提取液與傳統(tǒng)提取液的相對黏度均隨濃度的增大呈上升趨勢，但經(jīng)木瓜蛋白酶輔助提取后其提取液相對黏度較傳統(tǒng)提取相對液黏度增大，尤其當(dāng)濃縮比達(dá)1∶2時，酶解提取液的相對黏度較傳統(tǒng)提取液的相對黏度增加，而傳統(tǒng)提取液濃縮比為1∶3與1∶2時兩者相對黏度差異較小，見圖1。

圖1 傳統(tǒng)與木瓜蛋白酶酶解提取液相對黏度

2.4 木瓜蛋白酶提取枸杞粗多糖的體外抗氧化活性測定

2.4.1 枸杞粗多糖總還原力的測定［12］稱取一定量的枸杞藥材，按枸杞多糖木瓜蛋白酶酶解提取的最佳工藝條件提取，得到的枸杞提取液按“2.1.1”項下方法處理，質(zhì)量濃度按原藥材重量計算，配制成濃度為 2、4、8、12、16 mg/mL 的供試液，量取不同濃度的供試液 2.0 mL，各加pH 6.6的磷酸緩沖液 （0.2 mol/L）2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，混合液在50℃恒溫條件下反應(yīng)20分鐘，取出后迅速冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻后在3 000 r/min條件下離心10分鐘，取上清液2.5 mL于試管中，加蒸餾水2.5 mL后加0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL，混合均勻，室溫靜置10分鐘，于700 nm處測定其吸光度A，不加木瓜蛋白酶作空白對照，結(jié)果見圖 2。

圖2 木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖還原能力

2.4.2 枸杞粗多糖D PPH·清除率測定［13］稱取一定量的枸杞藥材，按枸杞多糖木瓜蛋白酶酶解提取的最佳工藝條件提取，得到的枸杞提取液按“2.1.1”項下方法處理，質(zhì)量濃度按原藥材重量計算，配置成濃度為 2、4、8、12、16 mg/mL 的供試液，量取不同濃度的供試液2.0 mL，各加入1mL用無水乙醇配制的DPPH·溶液，并使DPPH·終濃度為0.8 mmol/L。用力振搖混勻后置暗室中靜置30分鐘，于517 nm波長處測定吸光度，不加木瓜蛋白酶作空白對照。DPPH·清除率測定公式為：DPPH·清除率（%）=［A0-（A1-A2）］/A0×100%。式中 A1為加枸杞多糖溶液后DPPH·溶液吸光度值；A2為枸杞多糖溶液在測定波長的吸光度值；A0為未加枸杞多糖溶液DPPH·溶液吸光度值，結(jié)果見圖3。

圖3 木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖D PPH·清除率

3 討論

通過改良差示酚硫法的方法學(xué)考察可知，該方法用于枸杞多糖含量測定，具有簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點。改良差示酚硫法與傳統(tǒng)苯酚硫酸法相比，是將硫酸、水和苯酚預(yù)先混勻，放置室溫后再加入樣品液，有效克服了傳統(tǒng)方法加入濃硫酸放熱的條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)導(dǎo)致的多種誤差，且可用于測定含有雜質(zhì)的多糖樣品，減少了樣品中非糖雜質(zhì)的干擾，具有很好的實用價值。

均勻設(shè)計主要在實驗范圍內(nèi)考慮實驗點均勻散布以求通過最少的實驗來獲得最多的信息，因而其實驗次數(shù)較正交設(shè)計明顯減少，均勻設(shè)計特別適合于多因素多水平的實驗和系統(tǒng)模型完全未知的情況。木瓜蛋白酶是一種來源廣泛的植物蛋白酶，在酸性、中性、堿性環(huán)境下均能保持較高的活性，對蛋白質(zhì)、氨基酸酯以及酰胺等化合物的水解反應(yīng)具有良好的催化活性［14］。枸杞水煎液中有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在提取過程中遇熱凝固，影響其他有效成分的浸出。因此，采用木瓜蛋白酶對枸杞進(jìn)行預(yù)處理，可將蛋白質(zhì)水解成多肽及氨基酸類，遇熱不再凝固，從而促進(jìn)各種有效成分的增加。實驗選用均勻設(shè)計對多因素影響下的酶反應(yīng)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，相對于正交設(shè)計來說能減少實驗次數(shù)，快速發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件：木瓜蛋白酶用量為0.2%，pH為4.2，溫度為40℃，酶解時間為1.0小時。相同藥材條件下按此最佳工藝木瓜蛋白酶輔助提取枸杞多糖提取率為8.50%，而傳統(tǒng)提取率為4.77%。同時比較酶解提取液與傳統(tǒng)提取液的相對黏度發(fā)現(xiàn)，提取液相對黏度隨稠度及枸杞多糖濃度升高而增加，相同條件下，木瓜蛋白酶輔助提取后提取液可能由于枸杞多糖提取率升高而表現(xiàn)出較高的相對黏度。此外，檢驗枸杞多糖樣品的還原力及DPPH·清除率，結(jié)果顯示枸杞多糖具有顯著的抗氧化性和DPPH·清除能力，木瓜蛋白酶輔助提取法可通過提高枸杞多糖提取率有效提高枸杞多糖的還原力及DPPH·清除率。該結(jié)果將為枸杞進(jìn)一步開發(fā)和利用提供重要的參考價值。