劉光華 ,于 艷 ,王思源,王貴幫,吳振起,劉 娟
1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110847;2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院;3遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生院
甘露消毒丹方首載于清代醫(yī)家魏之琇所著的《續(xù)名醫(yī)類案》中[1],由滑石、茵陳、黃芩、連翹等藥物組成,具有利濕化濁,清熱解毒的功效,主治時(shí)疫侵體,濕溫互結(jié)證,臨床上廣泛應(yīng)用于多種病證[2-4],表現(xiàn)為發(fā)熱倦怠,或午后身熱,頤腫口渴,嘔惡,咽喉腫痛,肢酸,身目發(fā)黃,胸悶腹脹,泄瀉,淋濁,尿短色赤,舌苔淡白或厚膩或干黃,脈濡數(shù)或滑數(shù)。甘露消毒丹為治療濕熱并重,毒邪蘊(yùn)藉,肆逆氣分的主要方劑,辨證屬濕熱毒蘊(yùn)郁不解者,療效顯著。目前甘露消毒丹的提取尚缺乏質(zhì)量控制方面的研究,而HPLC是化學(xué)科學(xué)中最有優(yōu)勢(shì)的儀器分析方法之一,尤其在有機(jī)、高分子化合物結(jié)構(gòu)的確定方面具有優(yōu)勢(shì)[5]。故本實(shí)驗(yàn)采用 HPLC[6-8]波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定甘露消毒丹中綠原酸、黃芩苷、連翹苷3種成分含量[9-11],為甘露消毒丹的質(zhì)量控制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時(shí)為新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)基礎(chǔ)。
HH-4型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);AR2140型電子天平(上海奧豪斯公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);美國(guó)Agilent 1100高效液相色譜儀;G1379A真空脫氣機(jī);G1311A四元梯度泵;G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器;G1315A柱恒溫箱;G1315B二極管陣列檢測(cè)器;Agilent B04.03化學(xué)工作站;AE-240電子分析天平;KH-400DB型數(shù)控超聲波清洗器。中藥飲片購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室鑒定均為正品;黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):110715-200514)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào):110753-200413)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,連翹苷對(duì)照品(批號(hào):16041519)購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司,含量均大于98%。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司);水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司),其他試劑均為分析純。
2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm×250 mm,5 μm)色譜柱;檢測(cè)波長(zhǎng)0~20分鐘為327nm;20分鐘以后為230nm。柱溫30℃;流速1.0mL/min。流動(dòng)相:乙腈為流動(dòng)相A,0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相B,按表1進(jìn)行梯度洗脫。
表1 梯度洗脫程序
在上述色譜條件下,理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000,分離度>1.5,混合對(duì)照品與供試品色譜圖,見圖1。
圖1 混合對(duì)照品與供試品色譜圖
2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、綠原酸、連翹苷對(duì)照品適量,置同一量瓶中,加甲醇制成每 1 mL 含黃芩苷 39.8 μg、綠原酸 77.6 μg、連翹苷60.4 μg的混合對(duì)照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備 甘露消毒丹(滑石、茵陳、黃芩、石菖蒲、白豆蔻、藿香、木通、射干、川貝母、連翹、薄荷等11味中藥飲片)經(jīng)70%乙醇提取,回收溶劑,減壓濃縮,進(jìn)一步干燥得甘露消毒丹干粉。取本品粉末0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇20 mL,密塞,稱定重量,超聲處理30分鐘,放冷,再稱定重量,加甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液10 μL與供試品溶液5 μL,注入高效液相色譜儀,測(cè)定,用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各成分的含量,即得。
2.5 線性范圍考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μL,注入液相色譜儀中,記錄色譜峰面積。進(jìn)樣量X(μg)與色譜峰面積Y經(jīng)線性回歸,得回歸方程為:
綠原酸在 0.079 1~1.977 5 μg,黃芩苷在0.382 7~9.567 5 μg,連翹苷在 0.0652~1.6300μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液5 μL,注入高效液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果表明峰面積值的RSD分別為黃芩苷0.95%、綠原酸0.86%、連翹苷1.05%,表明本方法精密度良好(n=6)。
2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品(70%乙醇提?。┘?xì)粉6份,分別制備成供試品溶液,按樣品含量測(cè)定方法測(cè)定,結(jié)果顯示綠原酸、黃芩苷、連翹苷的平均含量分別為 0.536、4.099、0.364 mg/g,RSD 分別為綠原酸2.79%、黃芩苷3.57%、連翹苷2.10%,表明本方法重復(fù)性良好(n=6)。
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品(70%乙醇提?。┤芤海謩e在 0、2、4、6、8、12 小時(shí)測(cè)定峰面積,結(jié)果表明峰面積RSD分別為黃芩苷2.73%、綠原酸1.11%、連翹苷1.47%,表明本品溶液12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的供試品0.25 g,共計(jì)6份,置具塞錐形瓶中,分別精密加入混合對(duì)照品溶液(含綠原酸0.260 mg/mL,黃芩苷 2.095 mg/mL,連翹苷 0.170 mg/mL)2.0 mL,蒸干溶劑,按供試品溶液制備方法制備,進(jìn)行含量測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。
表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
2.10 樣品含量測(cè)定 取樣品,精密稱定,按上述方法制備成供試品溶液,再按本文選定的色譜條件測(cè)定峰面積,用外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種成分的含量,結(jié)果見表3。
表3 樣品中黃芩苷、綠原酸與連翹苷的含量測(cè)定 m g/g
甘露消毒丹以滑石、茵陳、黃芩為君藥,其中滑石通水利淋,清暑解熱;茵陳清利濕熱,退黃;黃芩清熱燥濕、瀉火解毒;三藥共奏利濕化濁、清熱滲濕之效。以石菖蒲、白豆蔻、藿香為臣藥,其中石菖蒲化濕和胃,滌痰辟穢;白豆蔻化濕行氣,溫中止嘔;藿香芳香化濕,辟穢和中止嘔;三藥均辛溫,宣泄氣機(jī),芳香化濕,于熱從治,于濕正治,齊做臣藥,尤宜于濕遏中焦之證。藿香、茵陳同用芳化清利、醒脾助運(yùn)、清熱化濁。余藥為佐藥,其中木通清利通淋,泄熱,又助滑石、茵陳給濕熱以出途;射干清熱解毒,祛痰利咽;貝母化痰止咳,清熱散結(jié),配射干增強(qiáng)清肺利咽之功;連翹清熱解毒,消癰散結(jié),其輕浮可透達(dá)內(nèi)外,攜黃芩可強(qiáng)化彼此之效;薄荷疏散風(fēng)熱,清利頭目,利咽為用;上五藥共為佐藥,彼此配伍尤能利咽化痰,開解散毒,暢達(dá)氣機(jī),通利水濕。諸藥聯(lián)用,以君三臣三佐五為制,具宣清降利之用,以利濕化濁,清熱解毒為治[12]。目前研究[13-15]表明黃芩苷為黃芩發(fā)揮功效作用的主要指標(biāo)性成分,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛、清除氧自由基等多種作用;綠原酸為茵陳的主要作用成分,具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素、保肝等作用[16-18];連翹苷為連翹的主要活性成分,具有抗炎、抗病毒、抗感染、解熱、抗氧化等作用[19-21]。
本試驗(yàn)建立了HPLC法以測(cè)定甘露消毒丹中3種成分含量,即綠原酸、黃芩苷和連翹苷,檢測(cè)過程采用波長(zhǎng)切換方法,其中色譜圖中顯示綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)為327 nm,而連翹苷的最大吸收波長(zhǎng)為228 nm處,黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為278 nm,由于黃芩苷和連翹苷均在230 nm處吸收峰峰形較佳,且分離度符合要求,為使操作簡(jiǎn)便、快速、易行,綠原酸在327 nm處進(jìn)行檢測(cè),黃芩苷和連翹苷則將波長(zhǎng)切換至230 nm處進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)中對(duì)供試品提取條件進(jìn)行了考察,分別采用水,30%、50%、70%、90%乙醇作為提取溶劑,計(jì)算其提取效率。結(jié)果顯示,采用70%乙醇作為提取溶劑可較好去除干擾雜質(zhì),所得綠原酸、黃芩苷和連翹苷含量較大,提取較完全,效果最佳。本試驗(yàn)曾比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水流動(dòng)相系統(tǒng),比較各組分的保留時(shí)間與分離度,經(jīng)反復(fù)嘗試與摸索,結(jié)果乙腈-0.1%磷酸水的分離效果好,且穩(wěn)定性、峰形均較好,拖尾因子及分離度均符合要求,且出峰時(shí)間適宜。故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。本試驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定甘露消毒丹中綠原酸、黃芩苷和連翹苷的具體含量,平均含量分別為2.389、28.362和4.354 mg/g,分離效果理想,重現(xiàn)性好,為臨床應(yīng)用及該方劑的進(jìn)一步研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。