朱敏杰

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

繼發(fā)性細(xì)胞凋亡是腎缺血再灌注損傷的重要病理機制［1］，因此以抑制細(xì)胞凋亡為靶點研究新型藥物或許是降低腎缺血再灌注損傷的有效途徑。大蒜素能通過降低氧化應(yīng)激損傷和抑制細(xì)胞凋亡對肝臟、腦組織缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用［2-3］；吳建偉等［4］研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能有效降低腎缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激損傷、改善腎功能，但大蒜素是否對腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡具有影響尚未見報道。本研究通過建立腎缺血再灌注大鼠模型，探討大蒜素對腎缺血再灌注損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 大蒜素注射液（上海禾豐制藥有限公司產(chǎn)品，批號：140617，規(guī)格：60mg∶5mL）；血清中尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）及尿酸（UA）試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；蘇木精-君紅（HE）、末端脫氧核苷酸?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP切口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（北京博奧森公司）；bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤因子2（bcl-2）、核因子 κB（NF-κB）單抗（碧云天生物技術(shù)有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）及丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由河北省實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型的制備與分組 將SD大鼠80只按隨機數(shù)字表法隨機分為假手術(shù)組、模型組及大蒜素低、中、高（5、10、20 mg/kg）劑量組，每組16只，于手術(shù)造模前7天開始腹腔注射給藥，1次/d。參照Chatterjee等［5］報道方法制備腎臟缺血再灌注損傷大鼠模型；假手術(shù)組大鼠除不夾閉腎蒂血管外，其余手術(shù)操作同模型組。再灌注6小時后，取材并進(jìn)行各指標(biāo)檢測。

1.3.2 腎臟指數(shù)的計算 稱取大鼠體質(zhì)量，麻醉后摘取腎臟組織并稱取左側(cè)腎臟重量，計算腎臟指數(shù)，

1.3.3 血清 BU N、SCr、U A含量測定 取腎臟組織前經(jīng)腹主動脈取血并1500rpm離心5分鐘，取血清，通過全自動生化分析儀測定各組大鼠血清 BUN、SCr、UA 含量。

1.3.4 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞凋亡狀況觀察 取稱量后的左側(cè)腎組織，于4%的多聚甲醛溶液中固定72小時后經(jīng)石蠟包埋、切片（厚度為 5 μm）、脫蠟水化處理后行常規(guī)HE染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化。石蠟組織切片經(jīng)脫蠟水化處理后，行TUNEL染色，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察，細(xì)胞核黃染為陽性著色。計算凋亡指數(shù)AI：每張切片隨機選取互不重疊6個視野，分別計數(shù)腎小球細(xì)胞總數(shù)和陽性著色細(xì)胞數(shù)，AI計算公式：凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

1.3.5 腎臟組織中 bcl-2、Bax、N F-kB蛋白表達(dá)檢測 取右側(cè)腎組織并研磨勻漿，經(jīng)12 000 rpm 4℃離心20分鐘取沉淀，采用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性（沸水浴加熱5分鐘）、上樣（每孔上樣30 μg），經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜、室溫下5%脫脂奶粉封閉2小時，滴加一抗（1∶500）bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin 4℃過夜，洗膜、二抗（1∶100）室溫孵育1小時后經(jīng)ECL系統(tǒng)顯影；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測定 bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)相對量并計算Bax/bcl-2比值。

1.3.6 腎臟組織中抗氧化酶活性和M D A含量測定 取“1.3.5”項下制備的組織勻漿液，3 000 rpm離心10分鐘后取上清液，通過紫外-可見分光光度計測定各組大鼠腎臟組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性和 MDA 含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟指數(shù) 模型組大鼠腎臟指數(shù)為（5.8±1.4）mg/g，較假手術(shù)組（3.5±0.6）mg/g 升高（P＜0.01）；大蒜素低、中、高劑量組腎臟指數(shù)分別為（5.3±1.6）mg/g、（4.4±1.2）mg/g、（3.7±0.9）mg/g，中、高劑量組大鼠腎臟指數(shù)較模型組降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血清BU N、SCr、U A含量 模型組大鼠血清BUN、SCr、UA含量較假手術(shù)組升高；而與模型組比較，大蒜素中、高劑量組能降低腎缺血再灌注損傷大鼠血清BUN、SCr、UA含量，見表1。

表 1 各組大鼠血清 BU N、SCr、U A含量（±s）

表 1 各組大鼠血清 BU N、SCr、U A含量（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

組別 只數(shù) BU N/（m m ol·L-1） SCr/（μm ol·L-1） U A/（m m ol·L-1）假手術(shù)組 16 6.4±1.3 26.1±3.4 68.2±11.3模型組 16 22.7±4.5△△ 54.9±7.0△△ 109.7±18.4△△大蒜素低劑量組 16 19.6±4.8 50.2±6.7 101.5±21.6大蒜素中劑量組 16 14.9±3.7▲ 44.3±6.5▲ 83.9±15.2▲▲大蒜素高劑量組 16 10.2±2.8▲▲ 36.8±5.2▲▲ 75.1±14.8▲▲

2.3 各組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)和腎小球細(xì)胞形態(tài)均未見異常；模型組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)腎小球體積增大、系膜增生，間質(zhì)區(qū)可見淋巴細(xì)胞浸潤，腎小球細(xì)胞呈空泡變性等病理形態(tài)學(xué)變化；與模型組比較，大蒜素各劑量組能改善腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織病變，其中以大蒜素高劑量組效果最為顯著，見圖1。

2.4 各組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡狀況 假手術(shù)組大鼠腎臟組織僅存在極少量的凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，大蒜素各劑量組腎缺血再灌注損傷大鼠腎小球細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，以大蒜素高劑量組效果最為顯著，見圖 2；與假手術(shù)組比較，模型組 AI 為（52.8±7.0）%，較假手術(shù)組（3.7±1.4）%升高（P＜0.01）；大蒜素低、中、高劑量組 AI 分別為（47.1±6.8）%、（36.5±6.3）%、（18.9±4.5）%，中、高劑量組 AI 較模型組降低（P＜0.05）。2.5 各組大鼠腎臟組織Bax、bcl-2、N F-kB蛋白表達(dá) 模型組大鼠腎臟組織中Bax、bcl-2、NF-kB蛋白表達(dá)及Bax/bcl-2比值較假手術(shù)組升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組Bax、NF-kB蛋白表達(dá)降低而bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bax/bcl-2 比值降低（P＜0.01），見圖 3、表 2。

圖1 各組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)變化（H E，×400）

圖2 各組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡狀況（TU N EL，×400）

圖3 各組大鼠腎臟組織Bax、bcl-2、N F-kB蛋白表達(dá)（W est ern bl ot t i ng）

表2 各組大鼠腎臟組織Bax、bcl-2、N F-kB蛋白表達(dá)及Bax/bcl-2比值（±s）

表2 各組大鼠腎臟組織Bax、bcl-2、N F-kB蛋白表達(dá)及Bax/bcl-2比值（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

組別 只數(shù) bcl-2/β-act i n Bax/β-act i n Bax/bcl-2 N F-kB/β-act i n假手術(shù)組 16 0.18±0.06 0.27±0.08 1.50±0.42 0.18±0.06模型組 16 0.27±0.10△△ 0.59±0.17△△ 2.16±0.57△△ 0.72±0.29△△大蒜素低劑量組 16 0.31±0.09 0.46±0.13 1.48±0.61▲ 0.58±0.31大蒜素中劑量組 16 0.43±0.14▲▲ 0.42±0.09▲ 0.98±0.45▲▲ 0.46±0.25▲大蒜素高劑量組 16 0.76±0.19▲▲ 0.34±0.11▲▲ 0.45±0.22▲▲ 0.28±0.14▲▲

2.6 各組大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和M D A含量 模型組大鼠腎臟組織中抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性較假手術(shù)組降低且MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組SOD、GSH-Px、CAT活性升高且MDA 含量降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和M D A含量（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織中抗氧化酶活性和M D A含量（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

組別 只數(shù) SO D/（U·m g-1） G SH-Px（U·m g-1） CA T（U·m g-1） M D A/（nm ol·m g-1）假手術(shù)組 16 13.2±1.5 10.2±1.4 2.5±0.7 3.2±0.6模型組 16 5.4±1.1△△ 6.0±0.9△△ 1.3±0.4△△ 12.3±1.4△△大蒜素低劑量組 16 6.2±1.4 6.5±1.1 1.6±0.5 10.8±2.3大蒜素中劑量組 16 8.0±1.3▲ 7.4±0.9▲ 1.9±0.4▲ 8.1±1.5▲▲大蒜素高劑量組 16 10.6±1.8▲▲ 8.6±1.5▲▲ 2.3±0.6▲▲ 5.6±1.2▲▲

3 討論

大蒜素是一種具有多種藥理學(xué)作用的二烯丙基三硫化物，本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠有效降低腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟指數(shù)，降低血清BUN、SCr、UA含量，改善腎臟組織病變，抑制腎小球細(xì)胞凋亡，提示大蒜素能抑制腎臟組織細(xì)胞凋亡，對腎缺血再灌注損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡過程由多種基因參與調(diào)控，其中Caspase是激活各種凋亡刺激因子的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)；bcl-2能抑制線粒體破裂，可直接與多種凋亡刺激因子結(jié)合而抑制caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax細(xì)胞毒性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用［6］；Bax具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變而釋放細(xì)胞色素C、激活促凋亡蛋白caspase-9，表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用［7］。此外，Bax能與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值能體現(xiàn)Bcl-2基因家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用［8］。氧化應(yīng)激損傷是細(xì)胞凋亡重要的誘發(fā)因素之一［9］，正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自 由 基 （ROS） 能 在 抗 氧 化 酶 （SOD、GSH-Px、CAT）的催化作用下被還原［10-12］，ROS過剩時將導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而生成終產(chǎn)物丙二醛（MDA），因此抗氧化酶活性和MDA含量能直接或間接反映機體的抗氧化能力。NF-κB為多效能核轉(zhuǎn)錄因子［13］，生理狀態(tài)下NF-κB以無活性形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到ROS攻擊時，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號而進(jìn)入胞核內(nèi)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤，誘導(dǎo)促凋亡信號釋放從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，NF-κB激活與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能有效下調(diào)促凋亡蛋白Bax、NF-κB蛋白表達(dá)、上調(diào)抑凋亡蛋白bcl-2表達(dá)并降低Bax/bcl-2比值，改善抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性，降低氧化應(yīng)激損傷。

總之，大蒜素可能通過抑制細(xì)胞凋亡而對腎缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用；其機制可能與大蒜素能調(diào)節(jié)Bax和bcl-2表達(dá)，降低Bax/bcl-2表達(dá)比值以及降低氧化應(yīng)激損傷，下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。