李 亮 ，姬艷蘇

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052；2武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院

黃芪是臨床用于治療心力衰竭的常用中藥，黃芪皂苷是黃芪強(qiáng)心的主要成分，也是許多抗心力衰竭中成藥的重要組成［1］。酪氨酸激酶2/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（Janus activated kinase2/signal transducer and activator of transcription3，JAK2/STAT3）廣泛參與血管生成與細(xì)胞增殖、分化和遷移［2］。既往研究［3-4］發(fā)現(xiàn)黃芪總皂苷能增強(qiáng)心肌梗死大鼠左心室的結(jié)構(gòu)和收縮功能，抑制心室重塑。羧基端活性段腦鈉肽（B-type natriuretic peptide，BNP）是國(guó)際公認(rèn)的診斷心力衰竭的血清標(biāo)志物，是心肌損傷高度

敏感和特異的指標(biāo)，有助于評(píng)估心力衰竭的診斷和治療效果。本研究進(jìn)一步觀察慢性心力衰竭大鼠微血管密度的變化，評(píng)價(jià)心肌JAK2/STAT3 mRNA和蛋白水平及黃芪總皂苷對(duì)JAK2/STAT3的干預(yù)作用，探討黃芪總皂苷抑制心室重塑、促進(jìn)血管新生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠70只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京），分籠飼養(yǎng)，每籠5只，食、水自由攝取。

1.2 主要儀器與試劑 ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）；DYY-IIIB 電泳儀（北京六一儀器廠）；轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad，美國(guó)）；GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)（Bio Imaging System，SYNGENE，英國(guó)）。大鼠血清B型尿鈉肽測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20150415）；Trizol Reagent（invitrogen）；Reverse Transcription Reagents Kit；Power SYBR Green PCR Master Mix Reagents Kit（Applied Biosystems，美國(guó)）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），小鼠抗大鼠抗體：VⅢ因子（Santa Cruz，美國(guó)），JAK2（ab39636，abcam，美國(guó)），STAT3（ab68153，abcam，美國(guó)），Actin（ab8226，abcam，美國(guó)）。黃芪總皂苷，純度72.7%，由西安開來(lái)生物工程有限公司提供（k150411）；卡托普利片（上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：AAA6059）。

1.3 復(fù)制慢性心力衰竭模型及給藥方法 大鼠心肌梗死后心力衰竭模型的復(fù)制參照文獻(xiàn)［3］方法制作，采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支造成急性心肌缺血后心力衰竭模型，以左心室射血分?jǐn)?shù)（Ejection fraction，EF）＜60%作為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，剔除死亡和未達(dá)到心力衰竭標(biāo)準(zhǔn)的大鼠后，將其余模型成功大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利50 mg/kg組及黃芪總皂苷10 mg/kg、20 mg/kg劑量組，每組8只，另設(shè)假手術(shù)組8只。灌服給藥，假手術(shù)組及模型組灌服等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.4 血清B型鈉尿肽前體物（N T-proBN P）含量檢測(cè) 給藥4周后于腹主動(dòng)脈取血，離心后留取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清NT-proBNP的含量。

1.5 心肌微血管密度（M V D）檢測(cè) 給藥結(jié)束后處死動(dòng)物，取出心臟，取心尖處梗死區(qū)邊緣部分心肌組織，用石蠟包埋組織塊，制作6 μm切片，行特異性VⅢ因子免疫組化染色。在400倍光鏡下，每張切片中隨機(jī)觀察3處，行血管計(jì)數(shù)，血管內(nèi)皮細(xì)胞均被染成黃、褐色，單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇、微小血管均予計(jì)數(shù)。

1.6 心肌BN P、JA K 2和STA T3m RN A表達(dá)檢測(cè) 總RNA的提取：采用Trizol法提取心肌組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和含量，瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性。取0.2μgRNA用于反轉(zhuǎn)錄。RNA反應(yīng)體系為10×RT Buffer 1.0 μL，MgCl2（25 mmol）2.2 μL，deoxy NTPs Mixture（2.5 mmol）2.0 μL，Random Hexamers（50 μmol）0.5 μL，RNase Inhibitor（20 U/L）0.2 μL，Multi Scribe Reverse Transcriptase（50 U/ μL）0.25 μL?；旌弦陨戏磻?yīng)物，離心后的0.2 μg RNA用RNase-free water補(bǔ)足反應(yīng)體系至 10 μL。反應(yīng)條件：25℃ 10min，48℃30分鐘，95℃5分鐘。PCR反應(yīng)體系為2×Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL（200 nm/L），Reverse Primer 0.5 μL（200 nm/L），cDNA Sample 0.5 μL，RNase-freewater11μL，反應(yīng)體系為 25μL?；旌弦陨戏磻?yīng)物，開始擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性10分鐘，95℃15秒，60℃1分鐘，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后使用ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)分析PCR過(guò)程中各檢測(cè)樣本的域值循環(huán)（threshold cycle，CT）數(shù)值，通過(guò)2-△△CT表示目的基因相對(duì)于β-actin的表達(dá)水平。引物序列如下：

1.7 心肌JA K 2和STA T3蛋白表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western-blot）技術(shù)檢測(cè) JAK2和STAT3蛋白表達(dá)，提取心肌組織總蛋白，取1 μL蛋白質(zhì)溶液，二聯(lián)喹啉酸（BCA）法進(jìn)行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，電泳完畢將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，TBST洗膜，將聚偏二氟乙唏膜（PVDF）加入封閉液中，常溫?fù)u動(dòng)，封閉結(jié)束，加1 mL的JAK2和STAT3 單克隆抗體（1∶1000 稀釋），4℃過(guò)夜，棄去反應(yīng)液，TBST清洗3次，10 min/次。在膜上加入熒光標(biāo)記的二抗（1∶20 000稀釋），室溫下輕輕振蕩1小時(shí)后取出膜，在磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中清洗3次，10 min/次。二抗孵育后在暗室內(nèi)進(jìn)行顯影和定影，標(biāo)定蛋白marker，用凝膠成像系統(tǒng)分析與掃描。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達(dá) 造模后5周，心肌梗死大鼠EF值為（53.9±4.9）%，＜60%，與假手術(shù)組 EF 值（84.7±5.4）%比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明模型復(fù)制成功。與假手術(shù)組相比，慢性心力衰竭大鼠血漿NT-proBNP含量和心肌BNP mRNA水平均增加（P＜0.05），黃芪總皂苷各劑量組和卡托普利50 mg/kg組可降低血漿NT-proBNP含量，并下調(diào)心肌BNP mRNA表達(dá)（P＜0.05）；卡托普利、黃芪總皂苷各給藥組間各指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達(dá)（±s）

表1 各組大鼠M V D、N T-proBN P及BN P m RN A的表達(dá)（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

組別 只數(shù) M V D N T-proBN P含量/（pg·m L-1） BN P m RN A表達(dá)假手術(shù)組 8 - 637.57±44.65 1.04±0.29模型組 8 9.86±3.44 706.17±34.56* 2.01±0.55**黃芪總皂苷10m g/kg組 8 14.43±3.41# 670.00±47.14 0.92±0.34黃芪總皂苷20m g/kg組 8 15.14±4.34# 630.86±58.69# 1.08±0.33##卡托普利50m g/kg組 8 15.29±4.03# 639.86±37.31# 0.97±0.37##

2.2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達(dá) 各組取6只大鼠進(jìn)行比較。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌JAK2 mRNA表達(dá)升高而STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。黃芪總皂苷20 mg/kg劑量組及卡托普利組可下調(diào)JAK2 mRNA表達(dá)，上調(diào)STAT3 mRNA表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組STAT3蛋白表達(dá)降低了50.7%（P＜0.01），黃芪總皂苷20 mg/kg劑量組能上調(diào)STAT3的蛋白水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠心肌JAK2的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組有升高趨勢(shì)，而各給藥組均有下調(diào)JAK2蛋白水平的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表 2、圖 1。

表2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠JA K 2和STA T3 m RN A的表達(dá)（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01;與模型組比較，#表示P＜0.05

組別 只數(shù) JA K 2 STA T3 m RN A 蛋白 m RN A 蛋白假手術(shù)組 6 1.06±0.33 0.18±0.06 1.02±0.18 0.71±0.18模型組 6 1.61±0.58* 0.25±0.09 0.75±0.09** 0.35±0.13**黃芪總皂苷10 m g/kg組 6 1.45±0.36 0.21±0.08 0.62±0.13 0.31±0.05黃芪總皂苷20 m g/kg組 6 1.16±0.21# 0.20±0.07 0.83±0.21# 0.63±0.20#卡托普利50 m g/kg組 6 1.20±0.28# 0.20±0.08 0.91±0.20# 0.46±0.13

圖1 黃芪總皂苷對(duì)心肌梗死后心力衰竭大鼠JA K 2和STA T3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

BNP是由心房和心室產(chǎn)生的一種肽類激素，心肌細(xì)胞首先合成BNP原，稱為proBNP，proBNP在蛋白酶的作用下裂解為NT-proBNP和生物活性激素BNP。兩種多肽等摩爾分泌并釋放入血循環(huán)，由于BNP的半衰期為22分鐘，而NT-proBNP的半衰期為120分鐘，而且體外穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)，結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取材和檢測(cè)時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)血清中較穩(wěn)定的NT-proBNP含量和心肌組織BNP的基因表達(dá)水平綜合評(píng)價(jià)BNP的變化情況。心力衰竭時(shí)BNP主要由心室細(xì)胞分泌，其合成與分泌主要受室壁張力調(diào)節(jié)，心力衰竭患者在循環(huán)容量超負(fù)荷時(shí)常合并左心室或全心擴(kuò)大，引起室壁張力增加，BNP被大量合成并釋放入血，血中濃度明顯增高，能直接反映心功能損傷或衰竭狀態(tài)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠血清NT-proBNP含量升高，BNP及基因表達(dá)上調(diào)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭大鼠左心室內(nèi)徑和容積明顯增加，相應(yīng)的室壁張力增強(qiáng)，而黃芪總皂苷可抑制心室重塑［3］，減小室壁張力并降低血清BNP濃度，證明黃芪總皂苷對(duì)慢性心力衰竭的治療效果。

心肌梗死后的血管新生是指將血管新生誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)入組織中，誘導(dǎo)缺血區(qū)側(cè)支毛細(xì)血管新生，改善缺血部位血供。應(yīng)用藥物促進(jìn)微血管新生，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成，完成缺血區(qū)血管的自我重建，是治療缺血性心臟病的有效手段。JAK2/STAT3通路是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）生成與遷移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，JAK2調(diào)控血管生成與細(xì)胞增殖、分化和遷移；STAT3是JAK2的重要底物，STAT3缺失時(shí)心肌毛細(xì)血管密度減少，梗死面積較正常增大，心臟功能受限，生存率下降。相反，STAT3過(guò)表達(dá)的大鼠梗死心臟中毛細(xì)血管密度增加，VEGF表達(dá)增加，梗死面積較野生型?。?］。STAT3的蛋白水平和活性的提高對(duì)早期和后期心肌缺血有保護(hù)作用，能調(diào)控在體心肌血管生長(zhǎng)，有助于心臟適應(yīng)各種應(yīng)激［2］。

黃芪總皂苷是黃芪的主要活性成分，其通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化碳保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成，利于心肌缺血區(qū)血管數(shù)目的增加［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪皂苷能增強(qiáng)心肌梗死大鼠的心臟收縮和舒張功能，抑制心室重塑，本研究中黃芪總皂苷對(duì)心力衰竭標(biāo)志物BNP在基因和血清學(xué)水平方面都有明顯改善作用，在mRNA和蛋白水平對(duì)JAK2/STAT3通路有干預(yù)作用，提示黃芪總皂苷促進(jìn)治療性血管新生可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路有關(guān)。本研究為黃芪總皂苷促進(jìn)心肌梗死后心力衰竭大鼠心肌血管新生的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，但關(guān)于黃芪總皂苷對(duì)心肌梗死后不同階段心肌血管新生的促進(jìn)作用與途徑尚未明確，仍需進(jìn)一步研究與探索。