劉 萍，段雅彬 ，陳紅凱，郝智紅，陳湘宏

1青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001；2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有2.2億糖尿病患者，其中2型糖尿病發(fā)病率高，在全球范圍內(nèi)呈逐年升高趨勢(shì)［1］。目前治療糖尿病的藥物主要為α-葡萄糖苷酶抑制劑以及胰島細(xì)胞增敏劑等。由于藥物的副作用導(dǎo)致其使用受限，因此從天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒的降血糖藥物成為研究熱點(diǎn)。

昆侖雪菊為菊科金雞菊屬，分布在昆侖山海拔3 000米左右的地區(qū)，昆侖雪菊維吾爾語(yǔ)為“古麗恰爾”，是維醫(yī)常用的藥材之一，有清熱解毒、活血化瘀、清肝明目、潤(rùn)腸通便等功效［2-4］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)［5-6］證明昆侖雪菊中含有大量的黃酮類物質(zhì)以及人體必需的礦物元素，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、清除自由基等作用。原花青素B2和綠原酸是昆侖雪菊的主要有效成分，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道昆侖雪菊中原花青素B2和綠原酸的分離和含量鑒定。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者主要對(duì)昆侖雪菊中的生物堿、總黃酮等物質(zhì)進(jìn)行了提取分離，但原花青素B2和綠原酸兩種單體成分的分離和含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用RP-HPLC法測(cè)定昆侖雪菊中原花青素B2和綠原酸的含量。采用鏈脲霉素和高脂飼料誘導(dǎo)高脂高糖小鼠模型，觀察昆侖雪菊的降血糖作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 昆侖雪菊（購(gòu)自青海省中藏藥材市場(chǎng)，經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥教研室鑒定）；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó) ChromaDex公司，批號(hào)：00016231-014，純度：97.2%）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：120753-2006879，純度：98%）；鏈脲霉素（Streptozocin，STZ，美國(guó)Sigma公司）；二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）；高脂飼料（江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司）。1.2 主要試劑 超氧化物歧化酶試劑盒（SOD，批號(hào)：20150105）及丙二醛試劑盒（MDA，批號(hào)：20150107）均購(gòu)自南京建成生物有限公司；石油醚為分析純（濟(jì)南泉魯中康化工有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（山東禹王實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 主要儀器 Aglient 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Aglient公司）；UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；TGL-16 B型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KA-1000型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-IIID型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；GA-3血糖儀（深圳市三諾電子有限公司）；RT-2100C酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；DRT-2N型電熱套（鄭州大城科工貿(mào)有限公司）；YDS-30東亞液氮容器（樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司）；BT224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；XW-80A漩渦混合器（上海醫(yī)大儀器廠）；中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.4 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量25～28 g，購(gòu)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，合格證號(hào)：SCXK（甘）2015-0001，分籠飼養(yǎng)。光照明暗12小時(shí)交替，自由飲水，溫度：（23±2）℃，濕度：50%～60%。

1.5 方法

1.5.1 藥物提取 取昆侖雪菊適量，中藥粉碎機(jī)打粉，用水作為提取溶劑，液料比 1∶20（m/v），60℃提取1小時(shí)，連續(xù)3次，合并每次所得濾液，石油醚脫脂，正丁醇萃取，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，冷凍干燥回收干粉，用水配制1 g/mL的溶液，4℃避光保存，待用。

1.5.2 原花青素B2和綠原酸的測(cè)定 取“1.5.1”項(xiàng)下溶液，加水溶液100 mL于棕色瓶中，0.45 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.5.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱定原花青素B2和綠原酸對(duì)照品1mg，加甲醇1mL，配制成1mg/mL的溶液。加甲醇分別配制成 1、2、5、10、25、50、80 μg/mL 的溶液。

1.5.4 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.01%磷酸；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：315 nm；線性洗脫見(jiàn)表1。

表1 線性洗脫

1.5.5 線性關(guān)系考察 取 1、2、5、10、25、50、80μg/mL對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，做直線回歸。原花青素B2和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：

結(jié)果表明原花青素B2和綠原酸在1～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.5.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取10 μg/mL對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，原花青素B2和綠原酸RSD分別為0.87%，0.95%，表明精密度良好。

1.5.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，精密稱定，按“1.5.2”項(xiàng)下方法操作測(cè)得原花青素B2和綠原酸RSD分別為1.4%，0.95%，表明重復(fù)性良好。1.5.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品5份，精密稱定，分別加入原花青素B2對(duì)照品46 μg，按“1.5.2”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算回收率。得原花青素B2和綠原酸平均回收率分別為101.2%、99.8%。RSD 分別為 1.02%、1.12%。

1.5.9 動(dòng)物分組 將60只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、陽(yáng)性組（二甲雙胍，200 mg/kg）、模型組及昆侖雪菊高（4 g/kg）、中（2 g/kg）、低（1 g/kg）劑量組，雌雄各半，每組10只。

1.5.10 給藥方法 昆侖雪菊高、中、低劑量組和陽(yáng)性組灌胃給予相應(yīng)藥物，對(duì)照組、模型組給予等容積生理鹽水，劑量為 0.02 mL/（g·d），連續(xù)14 天。

1.5.11 糖尿病模型制作 對(duì)照組正常飼料喂養(yǎng)，其余各組小鼠予高脂飼料喂養(yǎng)4周，喂養(yǎng)第29天腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液（100 mg/kg），對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，全程冰浴操作。60小時(shí)后各組小鼠禁食12小時(shí)，剪尾取血并測(cè)定小鼠空腹血糖值，選擇血糖≥11.1 mmol/L的小鼠為成功模型。

1.5.12 指標(biāo)檢測(cè) 造模前后以及給藥后7天和14天分別剪尾測(cè)定小鼠血糖值。末次給藥后摘眼球取血，2 500 r/min，離心15分鐘，制備血清，按照試劑盒方法測(cè)定小鼠SOD和MDA。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的兩因素多水平分析，若方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 原花青素B2和綠原酸樣品含量測(cè)定 按上述色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得其峰面積，并帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算原花青素B2和綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

圖1 H PLC測(cè)定昆侖雪菊中原花青素B2和綠原酸的含量

2.2 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響 造模前小鼠體質(zhì)量低于造模后（P＜0.05），陽(yáng)性組給藥后3、7和14天與模型組相比，體質(zhì)量呈增加趨勢(shì)。予昆侖雪菊提取物后小鼠體質(zhì)量回升（P＜0.05），尤以給藥后14天體質(zhì)量恢復(fù)最為明顯，見(jiàn)表3。

2.3 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響 造模后與對(duì)照組相比，各給藥組和模型組血糖值升高（P＜0.05）。給藥7天后，各給藥組血糖值與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥14天后，昆侖雪菊提取物各劑量組血糖值降低（P＜0.05），尤以高劑量組明顯。造模前后及用藥后昆侖雪菊各劑量組與陽(yáng)性組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表3 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

表3 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠體質(zhì)量的影響（±s）

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） 體質(zhì)量/g造模前 造模后 用藥后3天 用藥后7天 用藥后14天對(duì)照組 10 - 26.12±1.56 30.56±1.47 32.65±1.25 33.14±1.25 34.21±1.52模型組 10 - 26.25±1.88 31.25±1.99 29.65±1.28 26.55±1.48 25.98±1.21陽(yáng)性組 10 0.2 27.15±1.98 31.89±2.01 28.56±1.72 28.76±1.69 30.15±1.94雪菊高劑量組 10 4 26.98±1.74 31.25±1.25 29.41±1.49 29.54±1.87 31.25±2.25雪菊中劑量組 10 2 26.14±1.32 30.65±1.36 29.72±1.24 30.12±1.97 31.56±1.36雪菊低劑量組 10 1 26.54±1.58 30.98±1.75 28.98±1.47 29.12±1.57 31.31±1.47

表4 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響（±s）

表4 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響（±s）

注：*表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與造模后比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） 血糖/（m m ol·L-1）造模前 造模后 用藥后7天 用藥后14天對(duì)照組 10 - 3.99±0.56 4.12±0.75 3.45±0.32 3.95±0.62模型組 10 - 4.12±0.91 21.85±5.62* 20.56±4.31* 21.29±3.18*陽(yáng)性組 10 0.2 4.01±0.54 20.18±4.36* 19.62±3.35* 16.65±4.62*#△雪菊高劑量組 10 40 4.25±0.62 21.99±4.38* 18.64±3.96* 16.32±3.49*#△雪菊中劑量組 10 2 3.89±0.48 19.56±5.98* 19.62±4.25* 17.63±2.65*#△雪菊低劑量組 10 1 3.91±0.68 22.15±6.56* 20.65±3.59* 18.95±3.78*#△

2.4 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠SO D和M D A的影響 造模后小鼠 SOD 活力降低（P＜0.05），MDA 含量增加（P＜0.05），昆侖雪菊高、中、低劑量組SOD活力高于模型組（P＜0.05），MDA含量低于模型組（P＜0.05），陽(yáng)性組與昆侖雪菊各劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠SO D和M D A的影響（±s）

表5 昆侖雪菊提取物對(duì)糖尿病小鼠SO D和M D A的影響（±s）

注：*表示與對(duì)照組比較，P＜0.05；△表示與陽(yáng)性組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/（g·kg-1） SO D/（U·m g-1） M D A/（nm ol·m g-1）對(duì)照組 10 - 0.59±0.01 0.029±0.009模型組 10 - 0.23±0.01*△ 0.109±0.011*△陽(yáng)性組 10 0.2 0.41±0.02*# 0.067±0.011*#雪菊高劑量組 10 4 0.39±0.02*# 0.061±0.009*#雪菊中劑量組 10 2 0.35±0.02*# 0.084±0.015*#雪菊低劑量組 10 1 0.31±0.01*# 0.081±0.013*#

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-磷酸作為流動(dòng)相，嘗試了多個(gè)洗脫條件，最終的洗脫條件所分離的原花青素B2和綠原酸的分離度良好，基線平穩(wěn)。目前四氧嘧啶和鏈脲霉素是制作糖尿病模型廣泛使用的藥物，四氧嘧啶能通過(guò)產(chǎn)生大量自由基達(dá)到破壞胰島β細(xì)胞的作用，自由基能夠破壞DNA結(jié)構(gòu)，激活多聚ADP核糖體合成酶的活性，從而使輔酶I含量下降，mRNA功能受損，胰島素合成減少［7］。鏈脲霉素主要自行分解甲基正碳離子，與DNA呈鏈間交叉連結(jié)，使DNA烷化，并使受損的DNA難以修復(fù)，最終導(dǎo)致胰島素缺乏［8］。有文獻(xiàn)［9］證實(shí)四氧嘧啶對(duì)小鼠傷害較大，造模成功率低，容易因劑量導(dǎo)致動(dòng)物死亡，并且本研究需要觀察藥物的抗氧化作用，而四氧嘧啶引起的自由基過(guò)剩會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故本研究采用鏈脲霉素和高脂飼料誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型。

體內(nèi)大量自由基是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的重要因素［10］，SOD是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的重要酶，能清除自由基，保護(hù)胰島細(xì)胞［11-12］。MDA是體內(nèi)過(guò)氧化損傷標(biāo)志，可通過(guò)MDA間接了解過(guò)氧化損傷程度［13-15］。本研究結(jié)果顯示昆侖雪菊降低了小鼠血糖值，升高了SOD活力，降低了MDA含量，清除了機(jī)體內(nèi)的大量氧自由基，減輕了自由基對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，從而增加胰島素分泌，達(dá)到降低糖尿病小鼠血糖的目的。

糖尿病是復(fù)雜的多因素慢性疾病，從天然產(chǎn)物中尋找有效藥物有積極意義，本研究證實(shí)了昆侖雪菊能夠降低糖尿病小鼠血糖，有效成分可能是原花青素B2和綠原酸，其機(jī)制可能是提高體內(nèi)抗氧化酶的活力，從而保護(hù)胰島β細(xì)胞。但昆侖雪菊抗氧化的分子機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。