徐琛善，吳楠，海霞，王軍，田佳，劉香檬，鮑振博，彭錦星

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中紅外光譜快速檢測牛奶中土霉素的可行性研究

徐琛善，吳楠通信作者，海霞，王軍，田佳，劉香檬，鮑振博，彭錦星

（天津農(nóng)學院 工程技術學院，天津 300384）

將中紅外光譜技術與偏最小二乘判別法相結(jié)合，建立一種牛奶中殘留土霉素的快速檢測方法。配置62個純牛奶和62個摻雜有不同濃度土霉素（所摻土霉素濃度區(qū)間為0.02～30.00 mg/L）的牛奶樣品，在400～4 000 cm-1區(qū)間進行中紅外光譜采集。對原始光譜數(shù)據(jù)進行預處理之后，分別在全波段和分波段區(qū)間內(nèi)建立偏最小二乘判別模型，并進行對比分析。結(jié)果顯示，不同波數(shù)區(qū)間建模對摻雜土霉素牛奶的預判模型有較大影響。全波段和分波段區(qū)間所建模型對校正集樣品的判別正確率均達 100%，預測集樣品建模相關系數(shù)在0.995～0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好，其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)所建模型對預測集樣品的判別正確率均達90.0%。

牛奶；抗生素；中紅外光譜；偏最小二乘判別分析

隨著人們生活水平的提高，世界各地牛奶的消耗量持續(xù)增長。然而部分不合格牛奶中檢測到的有害物質(zhì)（如抗生素、三聚氰胺和尿素等）嚴重危害人體健康，引起消費者對牛奶食品安全的關注。土霉素屬于四環(huán)素類抗生素，具有廣譜抗病原微生物作用，是一種快速抑菌劑，高濃度時具有殺菌作用。土霉素類藥物常被用于治療奶牛的各種炎癥，可導致牛奶中土霉素的殘留。殘留在牛奶中的土霉素可能引起人們過敏，或在牛奶食品加工過程中抑制發(fā)酵劑的活性，進而導致乳制品工業(yè)損失。目前，牛奶中抗生素殘留物質(zhì)的分析方法有很多種，如傳統(tǒng)的微生物法、高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）、高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FLD）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等。張俊升等[1]利用固相萃取前處理，結(jié)合高效液相色譜-二極管陣列檢測器方法檢測牛奶中土霉素、金霉素的殘留量。汪善良等[2]比較了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜與膠體金試紙條兩種方法對牛奶中殘留土霉素等四環(huán)素類藥物的檢測，檢測限在40～80 μg/L之間。

雖然色譜及質(zhì)譜技術在牛奶抗生素殘留檢測方面較為成熟，能達到較低的檢測限，但前處理過程較復雜。近年來，光譜技術作為新興的一種無損、快速檢測技術，也被用于牛奶中抗生素殘留檢測，如近紅外光譜法、中紅外光譜法、熒光光譜法等。Sivakesava等[3]采用中紅外（Mid infrared，MIR）和近紅外（Near infrared，NIR）光譜法對牛奶中四環(huán)素進行了無損檢測。在不同濃度范圍內(nèi)（4～520，520～2 000和4～2 000 μg/L）分別建模，并進行對比分析，驗證模型的相關系數(shù)R為0.61～087，研究發(fā)現(xiàn)，中紅外法檢測牛奶中四環(huán)素的預測誤差要低于近紅外法。Wu等[4]用近紅外光譜法對牛奶中殘留的四環(huán)素進行了定性和定量分析，校正集和預測集的正確判別率分別達到100.0%和96.3%。由于紅外光譜技術不需要復雜的樣品前處理，操作簡單，成本低，可對樣品實現(xiàn)原位檢測，也被廣泛用于乳制品中其他摻雜物質(zhì)（如三聚氰胺）的檢測[5]。

偏最小二乘判別分析法（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，根據(jù)實際測量出的眾多變量值，來判斷研究對象如何分類。通過對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓練，產(chǎn)生校正集，并檢驗校正集的準確率。本文采用中紅外光譜結(jié)合偏最小二乘判別法對牛奶中殘留的土霉素進行檢測，建立土霉素摻雜牛奶和純牛奶的判別模型，并研究不同波數(shù)建模區(qū)間對判別模型的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

樣品為在網(wǎng)上超市購買的某品牌同一批次的純牛奶。土霉素標品粉末購自Solarbio（純度＞99%）。配制31個不同濃度梯度的土霉素摻雜牛奶，質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、18、20、25、30 mg/L。每個濃度梯度設2個重復，共62個樣品。同時準備62個純牛奶樣品。用中紅外儀器對這124個樣品的光譜數(shù)據(jù)進行采集。

1.2 光譜采集

采用美國 PerkinElmer 公司的傅里葉變換中紅外光譜儀，樣品池為儀器自配的衰減全反射附件。中紅外光譜的掃描范圍為 400～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1，掃描間隔為8 cm-1，掃描次數(shù)為 8次，每個濃度樣品測量兩次。

1.3 分析方法

利用unscrambler分析程序，對輸入的摻雜牛奶光譜數(shù)據(jù)進行多元散射校正，采用 Savitzky- Golary 方法對原始光譜數(shù)據(jù)進行平滑預處理，以減少對判別模型的干擾。然后采用PLS算法的Matlab程序包建立摻雜土霉素牛奶的判別模型。利用交互驗證（cross-validation）的方法來確定模型的最佳主成分數(shù)，利用測定值與模型計算值之間的建模相關系數(shù)（），內(nèi)部交叉驗證均方差（Root mean square errors of cross validation，RMSECV），預測相關系數(shù)（），預測均方差（Root mean square errors of prediction，RMSEP）等指標評定模型的質(zhì)量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 純牛奶和摻雜土霉素牛奶的中紅外光譜圖

圖1是純牛奶和摻雜土霉素牛奶樣品的中紅外光譜圖。整個光譜范圍內(nèi)，摻雜牛奶和純牛奶譜峰出現(xiàn)的位置基本相同，大致出現(xiàn)在1 080 cm-1和2 920 cm-1左右，看不出摻雜土霉素的明顯特征。這表明簡單的通過光譜形狀和譜峰位置很難判別牛奶中是否摻雜土霉素，故需要進一步借助化學計量學方法來進行判別。

圖1 純牛奶和摻雜土霉素牛奶的中紅外光譜圖

2.2 全波段分析

對主成分數(shù)的設定會直接影響PLS-DA的建模結(jié)果，如果設定的主成分數(shù)過高，會引入一些無用信息，同時延長建模時間；如果設定的主成分數(shù)過低，則可能因為缺失一些有用信息而導致模型預測能力降低[6]。由于主成分分析依賴所給數(shù)據(jù)，所以數(shù)據(jù)的準確性對分析結(jié)果影響也很大，因此分析之前剔除了數(shù)據(jù)中的異常值。圖2是PLS-DA模型的隨主成分數(shù)變化的散點圖。從圖2可以看出，主成分數(shù)為5時建立判別模型的為最小，因此本試驗PLS-DA模型建立的主成分數(shù)選擇為5個。

圖2 PLS-DA模型RMSECV隨主成分數(shù)的變化曲線

由于異常樣本會影響PLS-DA模型的穩(wěn)健性和預測精度[5]，本研究根據(jù)樣本在主成分得分散點圖上的分布，剔除6個樣品異常值之后建立模型。對剩余的118個樣品按照2∶1的比例分為2組，隨機選擇78個樣品作為校正集（摻雜牛奶和純牛奶樣品各39個），剩余的40個樣品作為預測集（摻雜牛奶和純牛奶樣品各20個），如表1所示。

表1 建立PLS-DA模型的校正集和預測集樣品分配

本試驗在全波段（400～4 000 cm-1）范圍內(nèi)對校正集78個樣品數(shù)據(jù)建立摻雜土霉素牛奶的判別模型（圖3）。PLS-DA分析中，變量為類別變量，對于兩類判別，摻雜土霉素牛奶和純牛奶的變量值分別設定為 1 和 0。當某一樣品預測值大于0.5 時，判定樣品為摻雜類，而當某一樣品預測值小于 0.5 時，判定樣品為未摻雜（純牛奶）類[5]。圖3是摻雜土霉素牛奶的PLS-DA模型對校正集的內(nèi)部樣品的預測結(jié)果。結(jié)果表明，對于土霉素摻雜與否的判別正確率達到100%。

圖3 PLS-DA模型對校正集內(nèi)部樣品的預測結(jié)果

為了驗證所建立PLS-DA模型的判別能力和準確性，用未參與建模的預測集40個樣品對該模型進行驗證。表 2 是模型對預測集樣品進行預測后的預測值及判別結(jié)果。結(jié)果表明，在全波段 （400～4 000 cm-1）范圍內(nèi)，40個樣品中共有4個樣品被誤判，其中2個純牛奶被誤判為摻雜土霉素牛奶， 2個摻雜牛奶被誤判為純牛奶。所建立模型的判別正確率為90.0%，預判結(jié)果良好。

表2 PLS-DA模型對預測集樣品的判定結(jié)果

2.3 分波段分析

光譜范圍對建立模型的性能和預測準確性有很大的影響，因此選擇合適的光譜波段建立模型非常重要。本文選取了2個不同的波數(shù)區(qū)間，即400～2 000 cm-1和2 000～4 000 cm-1分別建立了PLS-DA模型。表 3 給出了分波段和全波段區(qū)間下所建判別模型對校正集和預測集樣品的判別結(jié)果。由表3可知，2個分波段建模的主成分數(shù)都為4，用全波段建模的主成分數(shù)為5。利用校正集建立模型對牛奶是否摻雜土霉素進行判別時，不論是分波段還是全波段，模型的判別準確率都達到100%。波段為400～2 000 cm-1時，校正集建模相關系數(shù)較低（＝0.862），其余2個波段的建模相關系數(shù)均超過0.900。波段為2 000～4 000 cm-1時，模型的最低，為0.354 3 mg/L。通過預測集驗證模型，3個不同建模波段的相關系數(shù)在0.995到0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好。波段為2 000～4 000 cm-1時，模型的相關系數(shù)最高，也比其他2個波段要高。波段為400～2 000 cm-1時，模型對預測集樣品摻雜與否的判別準確率為87.5%，而其他2個波段所建模型對樣品摻雜與否的判別準確率均為90.0%?？傮w分析，全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)的PLS-DA建模效果要優(yōu)于400～2 000 cm-1波段。上述結(jié)果表明，不同波數(shù)區(qū)間建模對摻雜土霉素牛奶的預判模型有較大影響。

表3 基于分波段和全波段的PLS-DA模型的校正預測分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用中紅外光譜法對純牛奶中摻雜的土霉素（所摻土霉素質(zhì)量濃度為0.02～30 mg/L）進行檢測。在全波段區(qū)間所建的PLS-DA模型對78個校正集樣品的判別正確率為 100.0%，對40個預測集未知樣品的判別正確率為90.0%。分別在分波段和全波段區(qū)間下建立模型對預測集樣品進行判別，建模相關系數(shù)在0.995到0.997之間，表明所建模型的擬合效果良好。其中全波段和2 000～4 000 cm-1波段內(nèi)所建模型對預測集樣品的判別正確率均達到90.0%，優(yōu)于400～2 000 cm-1波段的判別正確率87.5%。研究表明，基于中紅外光譜的檢測方法可為無損檢測牛奶中是否摻雜土霉素等抗生素提供一種快捷簡單的方法。盡管本研究只對抗生素摻雜牛奶做了定性分析，但該方法可以初步判斷牛奶中是否含有抗生素，作為高效液相色譜法的補充，并提高檢測效率。

[1] 張俊升，李亞琳，王欽暉，等. 固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定牛奶中土霉素、金霉素的殘留量[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2006，25（5）：30-32.

[2] 汪善良，吳鵬，劉琳，等. 膠體金試紙條法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中四環(huán)素類藥物殘留比較[J]. 乳業(yè)科學與技術，2011，34（6）：268-271.

[3] Sivakesava S，Irudayaraj J. Rapid determination of tetracycline in milk by FT-MIR and FT-NIR spectroscopy[J]. Journal of Dairy Science，2002，85（3）：487-493.

[4] Wu N，Xu C S，Yang R J，et al. Detection of tetracycline in milk using NIR spectroscopy and partial least square[J].IOP Conference Series：Earth and Environmental Science，2018，113：012004.

[5] 楊仁杰，劉蓉，徐可欣. 基于近紅外光譜對牛奶中摻雜尿素的判別分析[J]. 食品科學，2012，33（16）：120-123.

[6] 廖彩淇，孫長虹，楊瀟，等. 基于近紅外光譜紅茶中胭脂紅色素的判別[J]. 天津農(nóng)學院學報，2018，25（1）：72-75.

責任編輯：楊霞

Feasibility of rapid detection of oxytetracycline in milk by mid-infrared spectroscopy

XU Chen-shan, WU NanCorresponding Author, HAI Xia, WANG Jun, TIAN Jia, LIU Xiang-meng, BAO Zhen-bo, PENG Jin-xing

（College of Engineering and Technology, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The method for rapid detection of oxytetracycline residues in milk was established by combining mid-infrared （MIR） spectroscopy with partial least squares discriminant analysis（PLS-DA）. Firstly, 62 pure milk samples and 62 milk samples adulterated with different concentrations of oxytetracycline（0.02-30.00 mg/L）were prepared respectively. The MIR spectra of all samples were collected in the range of 400-4 000 cm-1. After the pretreatment of original spectral data, the PLS-DA models were established in the full band and sub band ranges, respectively. The results show that different wave-number ranges had a great influence on the prediction model of milk adulterated with oxytetracycline. The classification accuracies of the constructed PLS-DA models were 100% for calibration set in the full band and sub band ranges, and the correlation coefficients of models were between 0.995 and 0.997 for prediction set, which shows that the models had a good fitting effect. The classification accuracies of constructed models in the full band and in the range of 2 000-4 000 cm-1were 90.0% for prediction set.

milk; antibiotics; mid-infrared spectroscopy; partial least squares discriminant analysis

1008-5394（2018）03-0070-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.015

0657.33

A

2018-06-19

國家自然科學基金項目（21607114，41771357）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201810061206）

徐琛善（1996－），男，本科在讀，主要從事環(huán)境與新能源方面的研究。E-mail：1209148248@qq.com。

吳楠（1984－），女，講師，博士，主要從事環(huán)境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。