楊靜慧，周旖旎，黃唯子，劉艷軍，吳楠，盧云慧

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青睞苜蓿耐鹽突變體愈傷組織過(guò)氧化物同工酶特性分析

楊靜慧1a,1b，周旖旎1a，黃唯子1a，劉艷軍1a，1b，吳楠1c，盧云慧2

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 a. 園藝園林學(xué)院，b. 植物組織培養(yǎng)工程技術(shù)和誘變育種中心，c. 工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384； 2. 天津綠茵景觀生態(tài)建設(shè)股份有限公司，天津 300384）

苜蓿是一種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值作物，為了解其耐鹽突變體愈傷組織與普通愈傷組織的差異，以突變體與對(duì)照為材料，對(duì)突變體兩個(gè)生長(zhǎng)階段的過(guò)氧化物同工酶特性進(jìn)行比較，分析同工酶帶型及同工酶各條帶過(guò)氧化物酶的含量。結(jié)果表明：對(duì)照苜蓿的兩個(gè)重復(fù)均出現(xiàn)7條酶帶p1～p7，耐鹽突變體出現(xiàn)5條譜帶，缺失的酶帶遷移率分別是0.430和0.733。酶譜的相似性系數(shù)為0.833。突變體綠色愈傷的主帶譜帶p1（0.147）、p2（0.263）和p7（0.864）的著色色度和帶寬與對(duì)照基本相同。說(shuō)明主要基因一致。各酶帶活性分析顯示，除p2酶帶外，5條共有的酶帶中，均為突變體黃色愈傷的酶含量最低。對(duì)照苜蓿中遷移率小的p1和p3酶帶含量最高，突變體綠色愈傷遷移率大的p4、p7酶含量最高。同工酶總含量中，對(duì)照苜蓿最高（56.645 0 mg/mL），突變體綠色愈傷居中（49.653 0 mg/mL），突變體黃色愈傷組織最少（42.806 0 mg/mL）?？傊?，耐鹽苜蓿突變體的過(guò)氧化物酶種類(lèi)和含量的減少說(shuō)明發(fā)生了基因遺傳背景上的變異。

苜蓿；耐鹽；突變體；愈傷組織；過(guò)氧化物同工酶

苜蓿（L.）作為豆科苜蓿屬多年生草本，是世界上最重要、種植面積最廣的豆科牧草之一，因其適應(yīng)性廣、產(chǎn)草量高，且富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被譽(yù)為“牧草之王”，是優(yōu)良的飼料與綠肥[1]。近年來(lái)，我國(guó)畜牧業(yè)尤其是奶業(yè)發(fā)展迅速，對(duì)苜蓿的需求量日益增加，但我國(guó)苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要，苜蓿產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。我國(guó)人口眾多，土壤緊張，又有較大面積的鹽堿地，鹽堿地面積約4 000萬(wàn)hm2，約占陸地面積的25%，僅海岸帶、灘涂就在667萬(wàn)hm2以上[3]。天津也有大片的鹽堿地，大多數(shù)苜蓿品種能夠在其輕度鹽堿地如靜海、西青等地區(qū)栽培。

廣泛存在于植物體內(nèi)的過(guò)氧化物同工酶是植物適應(yīng)環(huán)境變化并作出靈敏反應(yīng)的一類(lèi)酶, 常被認(rèn)為是植物對(duì)逆境環(huán)境抗逆作用大小的標(biāo)志，是一種重要的遺傳標(biāo)記[4-5]，同工酶是催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組酶，幾乎存在于所有生物的所有組織中[6-7]。同工酶從遺傳學(xué)角度可分為4類(lèi)：①單基因決定的同工酶；②多基因決定的同工酶；③復(fù)等位基因決定的同工酶；④修飾同工酶或次生同工酶。同工酶在植物系統(tǒng)學(xué)研究中已有廣泛應(yīng)用，用于研究植物間的親緣關(guān)系，并獲得了較為準(zhǔn)確的結(jié)果[8-11]。如以酶距作為種屬間酶譜分析的數(shù)量化指標(biāo)，采用排序法對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行比較分析[12]。研究顯示在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，同工酶的多種分子形式具有階段特異性和組織特異性[13]。

植物過(guò)氧化物同工酶的多寡和有無(wú)與植物不同發(fā)育時(shí)期有密切關(guān)系。水稻（）、高粱、小麥（）和長(zhǎng)穗堰麥草種子在萌動(dòng)以前，過(guò)氧化物同工酶很少, 待幼芽長(zhǎng)到0.5～1 cm 以后，過(guò)氧化物酶才得到充分的表達(dá)[14]。靳月華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在長(zhǎng)白山高山苔原帶的圓葉柳（）和長(zhǎng)圓葉柳（）比垂柳等其他4種普通柳樹(shù)分別多了7 條和5 條新的同工酶譜帶, 這正是適應(yīng)高山惡劣生態(tài)條件的生理調(diào)節(jié)功能和遺傳基礎(chǔ)。鄒春靜等[13]認(rèn)為，酶帶的變異往往表現(xiàn)在非標(biāo)志帶上, 造成它在酶帶數(shù)目及遷移率上存在差異（質(zhì)的差異）或酶相對(duì)活性上不同（量的差異）。

過(guò)氧化物同工酶對(duì)環(huán)境反應(yīng)很靈敏[16-17]。污染區(qū)植物的過(guò)氧化物同工酶含量增高, 酶帶增多, 酶活性增強(qiáng)；并且酶帶數(shù)目、酶含量、酶活性等變化幅度小的過(guò)氧化物同工酶抗空氣污染能力強(qiáng)[4]。在鹽脅迫下，耐鹽水稻在經(jīng)過(guò)10 g/L Nacl 脅迫后，過(guò)氧化物同工酶增加，而對(duì)鹽敏感的水稻側(cè)根系內(nèi)過(guò)氧化物同工酶減少[18]。一般耐鹽與正常品種根內(nèi)過(guò)氧化物同工酶比較穩(wěn)定或略有減少現(xiàn)象。過(guò)氧化物同工酶的變化與植物耐鹽與鹽敏感特性存在一定的相關(guān)性[13]。

本研究以青睞苜蓿對(duì)照和耐鹽突變體為試材，采用非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）方法檢測(cè)兩者過(guò)氧化物同工酶的特性，為突變體的鑒定等提供依據(jù)。

1 材料與方法

青睞苜蓿愈傷組織和青睞苜蓿耐鹽突變體愈傷組織由天津農(nóng)學(xué)院園林植物教研室提供。

試驗(yàn)于2017年3月9日進(jìn)行，取青睞苜蓿愈傷組織為對(duì)照，青睞苜蓿耐鹽突變體綠色愈傷組織和黃色愈傷組織為兩個(gè)處理。

愈傷組織培養(yǎng)方法：愈傷組織培養(yǎng)按照楊靜慧等[20]的方法。

同工酶電泳方法：采用非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE），參照張東向等[21]的方法，并略作改動(dòng)。分離膠濃度為8%，pH 8.8；濃縮膠濃度為4%，pH 6.8。電極緩沖液為T(mén)ris-甘氨酸系統(tǒng)（pH 8.0）。點(diǎn)樣量為10 μL。過(guò)氧化物酶染色采用聯(lián)苯胺染色法。

1.1 制備樣品

將3種愈傷組織分別加入2 mL離心管中，每種顏色0.3 g，各加入1 mL的pH為8.0的提取液，放入高通量組織研磨儀中研磨1 min，頻率為26 Hz。研磨后取出離心管中的小鋼珠，放入臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)中離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，溫度為4 ℃。離心后用微量移液器各取出上清液，加入到新的離心管中。

1.2 點(diǎn)樣

每樣品取7 μL，各加入3 μL蔗糖溶液和0.5 μL溴酚藍(lán)，混合后用微量移液器緩慢滴入膠片的凹槽中，1個(gè)對(duì)照，2個(gè)處理，每處理重復(fù) 3次。

1.3 電泳

電泳的初始電壓為80 V，待樣品到達(dá)分離膠和濃縮膠分界線時(shí)改為120 V。等樣品到達(dá)距離底部1 cm時(shí)結(jié)束電泳。

隨現(xiàn)代信息和經(jīng)濟(jì)全球化的快速發(fā)展，中國(guó)的音樂(lè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)唱片產(chǎn)業(yè)到數(shù)字產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)變。根據(jù)中國(guó)音樂(lè)產(chǎn)業(yè)現(xiàn)階段的發(fā)展?fàn)顟B(tài)來(lái)看，筆者將音樂(lè)產(chǎn)業(yè)分為兩種類(lèi)型：以盈利性為主的音樂(lè)活動(dòng)、非盈利性的音樂(lè)活動(dòng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿過(guò)氧化物同工酶帶型分析

圖1和圖2顯示，對(duì)照苜蓿和耐鹽突變體苜蓿表現(xiàn)出的帶型不同。對(duì)照苜蓿（CK）的兩個(gè)重復(fù)均顯示出現(xiàn)7條酶帶（p1～p7），它們的遷移率（）依次是0.147、0.263、0.369、0.399、0.430、0.733和0.864；耐鹽突變體苜蓿均只有5條帶，分別是p1、p2、p3、p4和p7。比對(duì)照少了兩條 酶帶，缺失的是p5和p6。酶譜的相似性系數(shù)為0.833。

比較耐鹽突變體愈傷組織和對(duì)照的同工酶，發(fā)現(xiàn)主帶譜帶（p1，p2和p7）的著色色度和帶寬基本相同。

圖1 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶電泳圖譜

圖2 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶酶譜模式圖

2.2 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶酶活性分析

各酶帶的顏色深淺和帶寬不同，即酶活性不同，詳見(jiàn)表1。p1酶帶：對(duì)照最高，達(dá)到12.967 0 mg/mL，高于耐鹽突變體，兩個(gè)突變體差異不大。p2酶帶：黃色愈傷突變體最高，為9.928 5 mg/mL，其次是綠色愈傷突變體，為9.748 3 mg/mL，對(duì)照最低，只有8.011 2 mg/mL。p3酶帶：對(duì)照＞綠色愈傷突變體＞黃色愈傷突變體。p4酶帶：綠色愈傷突變體略大于對(duì)照，對(duì)照高于黃色愈傷愈傷組織。p7酶帶：綠色愈傷突變體＞對(duì)照＞黃色愈傷突變體?？傊?，除p2酶帶外，5條共有的酶帶中，均為黃色愈傷突變體的酶含量最低。p1酶帶和p3酶帶兩個(gè)遷移率小的酶帶中對(duì)照苜蓿的酶含量最高，其余的p4、p7兩個(gè)遷移率大的酶帶中綠色愈傷突變體最高。

表1 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物酶含量分析 mg/mL

如表1所示，對(duì)照組與綠色、黃色愈傷組織各酶帶的差異顯著性分析看出，p1條帶綠色和黃色愈傷組織酶含量極顯著低于對(duì)照組，兩種突變愈傷組織間無(wú)顯著差異，p2條帶綠色和黃色愈傷組織酶含量極顯著高于對(duì)照組，p3和p4條帶中，黃色愈傷組織與綠色愈傷組織以及對(duì)照組有極顯著差異，綠色愈傷組織與對(duì)照組差異不顯著；p7條帶中酶總量對(duì)照組、綠色愈傷組織、黃色愈傷組織之間兩兩均有著極顯著的差異。

2.3 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶總含量比較

圖3所示，耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶總含量不同。表現(xiàn)為對(duì)照苜蓿最高、突變體綠色愈傷組織居中，突變體黃色愈傷組織最少。其中對(duì)照苜蓿的過(guò)氧化物同工酶含量為56.645 0 mg/mL，突變體綠色愈傷組織為49.653 0 mg/mL，突變體黃色愈傷組織為42.806 0 mg/mL。

在正常條件下，耐鹽種類(lèi)酶帶數(shù)量少的結(jié)果與鄒春靜的研究一致，她認(rèn)為正常品種根內(nèi)過(guò)氧化物同工酶比較穩(wěn)定或略有減少現(xiàn)象。過(guò)氧化物同工酶的變化與植物耐鹽與鹽敏感特性存在一定的相關(guān)性[13]。

圖3 耐鹽突變體苜蓿與對(duì)照苜蓿愈傷組織過(guò)氧化物同工酶總含量

2.4 耐鹽突變體愈傷組織不同發(fā)育時(shí)期過(guò)氧化物同工酶帶型和含量分析

如圖1和圖2所示，苜蓿耐鹽突變體綠色愈傷組織的過(guò)氧化物同工酶帶型和其黃色愈傷組織均有5條帶，說(shuō)明其遺傳特性完全一致。綠色愈傷組織生長(zhǎng)到一定時(shí)期，細(xì)胞失綠、生長(zhǎng)衰弱、老化，因而變成黃色。這樣發(fā)育到兩個(gè)階段的愈傷組織同工酶并未出現(xiàn)差異，表現(xiàn)出遺傳上的穩(wěn)定性，這也是許多學(xué)者用同工酶研究植物的親緣關(guān)系的原因[8-11]。

但是，發(fā)育到不同階段的組織，同工酶含量有不同的變化[14]。本研究中過(guò)氧化物同工酶的數(shù)量隨組織的衰老而減少。這與陳燕珍等[22]的研究一致。即同一植株不同部位的HLP同工酶活性存在差異，中部成熟葉的酶活性（6.89×103U/g）＞底部衰老葉的酶活性（5.38×103U/g）。所以，可以用同工酶數(shù)量或活性衡量植物的生長(zhǎng)狀態(tài)。

在綠色愈傷組織和黃色愈傷組織中，遷移率不同的酶帶，其過(guò)氧化物酶含量也不同。在黃色愈傷組織中遷移率低的酶帶（如p1和p2）含量高，遷移率高的酶帶中，綠色愈傷植物的含量高。換句話說(shuō)，衰老的組織中過(guò)氧化物同工酶遷移率高的酶含量高，新鮮組織中遷移率低的同工酶含量高，見(jiàn)圖4。

圖4 苜蓿耐鹽突變體愈傷組織不同階段過(guò)氧化物同工酶含量

3 討論

逆境對(duì)植物的影響通常表現(xiàn)在多個(gè)方面，其中活性氧的清除系統(tǒng)是植物適應(yīng)逆境的常見(jiàn)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。通常情況下，逆境能夠破壞植物自身的代謝平衡，使活性氧含量上升，從而使細(xì)胞氧化作用加劇，進(jìn)一步破壞植物組織。當(dāng)植物感受到逆境時(shí)，增強(qiáng)活性氧清除系統(tǒng)的功能，維持植物體內(nèi)的代謝平衡。在本試驗(yàn)中，兩種苜蓿耐鹽突變體材料與對(duì)照組相比，過(guò)氧化物同工酶的總量以及條帶數(shù)均下降，這一現(xiàn)象可能由于本身的基因突變?cè)斐?。由于耐鹽突變體是經(jīng)過(guò)高鹽環(huán)境的篩選而得到，其適應(yīng)鹽脅迫的機(jī)理不得而知，因此對(duì)于這一現(xiàn)象的解釋需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)苜蓿耐鹽突變體與對(duì)照組在過(guò)氧化物同工酶角度的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)耐鹽苜蓿突變體的過(guò)氧化物同工酶總量小于對(duì)照組，且同工酶帶型與對(duì)照組相比少了兩個(gè)條帶，推測(cè)其發(fā)生了遺傳背景上的變異。

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責(zé)任編輯：楊霞

Analysis of peroxidase isoenzymes characteristics in salt-tolerant callus of alfalfa mutants

YANG Jing-hui1a,1b，ZHOU Yi-ni1a, HUANG Wei-zi1a, LIU Yan-jun1a,1b, WU Nan1c, LU Yun-hui2

（1. Tianjin Agricultural University a. College of Horticulture and Landscape, b. Engineering Technology Center for Plant Tissue Culture and Mutation Breeding, c. College of Engineering and Technology, Tianjin 300384, China；2. Tianjin LüYIN Landscape and Ecology Construction Co., Ltd, Tianjin 300384, China）

Alfalfa is a kind of high economic value crop. In order to understand the differences between salt-tolerant mutant callus (ST mutant) and common variety callus (CK) of alfalfa, the characteristics of peroxidase isoenzymes type and the content of isozyme were compared between the CK and ST mutant in two development stages of the mutant callus. The results showed that there were seven zymogram bands(p1-p7) in the CK, while there were only five zymogram bands in ST mutant with lack of two bands in0.430 and0.733. The similarity coefficient of the zymogram was 0.833. The chromaticity and band width of the main isoenzyme bands p1 (0.147), p2 (0.263) and p7 (0.864) of green ST mutant callus were similar with that of CK. It indicated that their major genes were consistent. The analysis of isoenzyme activity showed that the isoenzyme content of yellow ST mutant callus was the lowest in 5 common isoenzyme bands except for p2 band. The content of p1 and p3 bands with short mobility was the highest in CK, while the content of p4 and p7 with large mobility was the highest in green ST mutant. The total content of isoenzymes was the highest (56.645 0 mg/mL) in CK, green ST Mutant was in the midium (49.653 0 mg/mL) and yellow ST mutant was the least in (42.806 0 mg/mL). In conclusion, the less isoenzyme bands of ST mutant indicated a variation in the genetic background.

alfalfa; salt tolerance; mutant; callus; peroxidase isoenzymes

1008-5394（2018）03-0029-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.03.006

S541.9

A

2017-03-24

天津市農(nóng)委項(xiàng)目（201502100）；天津市科委項(xiàng)目（16YFZCNC00750，15PTSYJC00130）

楊靜慧（1961 -），女，教授，博士，主要從事園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。