楊雅媛 宋仁德 韓 玲 高永芳 余群力 馬君義

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730070； 2.青海省玉樹州畜牧獸醫(yī)工作站， 玉樹 815000； 3.青海百德投資發(fā)展有限公司， 西寧 810008)

0 引言

青海玉樹牦牛主要生長在平均海拔4 500 m左右的高山草原，其空氣含氧量僅為海平面的50%[1-2]，甘肅甘南牦牛主要分布于海拔3 000 m左右的甘南草原，甘肅張掖地區(qū)的西門塔爾牛×秦川牛(西雜牛)主要生活在約1 500 m的農(nóng)區(qū)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與低海拔地區(qū)的牛肉相比，高海拔地區(qū)牛肉中糖酵解強(qiáng)度增加，是由于牦牛為適應(yīng)高原環(huán)境而產(chǎn)生高原適應(yīng)現(xiàn)象，通過增加糖酵解來維持三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)生[3-5]。研究表明，牦牛機(jī)體中存在適應(yīng)低氧環(huán)境的特有代謝機(jī)制，以達(dá)到低氧條件下的能量供求平衡，其中5′-一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作為重要的細(xì)胞能量傳感器，在調(diào)節(jié)能量代謝和肉質(zhì)中起重要作用[6-9]。

低氧條件下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，代謝加強(qiáng)，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的5′-一磷酸腺苷(5′-AMP)和AMPK的γ-亞基相互作用，激活A(yù)MPK[9]。DING等[10]對3種不同海拔高度牦牛中乳酸脫氫酶(LDH)活性研究顯示，該酶與海拔高度呈正相關(guān)關(guān)系，LDH是無氧糖酵解的關(guān)鍵酶，更高海拔的牦牛更加依賴能量代謝供應(yīng)。LIN等[11]通過對牦牛與平原肉牛背最長肌中LDH活性比較發(fā)現(xiàn)，LDH在牦牛中表現(xiàn)出更高的酶活力，與平原肉牛相比，牦牛背最長肌更傾向于糖酵解代謝。SHEN等[12]對3種不同海拔高度豬種糖酵解潛力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，與平原品種相比，較高海拔品種具有較低的能量代謝水平。因此，有必要對不同海拔高度、低氧環(huán)境下能量代謝及AMPK活性的變化進(jìn)行進(jìn)一步研究。本文研究不同海拔高度牛宰后牛肉成熟過程中AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表達(dá)量、AMPK活力對糖酵解以及能量代謝的影響，為建立宰后牦牛肉能量代謝理論體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料儀器與試驗(yàn)方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：玉樹牦牛樣本采自青海省玉樹藏族自治州(海拔4 500 m左右)，甘南牦牛樣本采自甘肅省甘南藏族自治州(海拔3 000 m左右)，西門塔爾雜交牛樣本采自甘肅省張掖地區(qū)(海拔1 500 m左右)，選取生長發(fā)育正常、健康無病、平均年齡2～4歲，體質(zhì)量(200±20)kg，雌雄各半的3類樣本各10頭，宰前禁食16～18 h，禁水2 h。屠宰后立即取牛胴體中部背最長肌肉樣，置于0～4℃環(huán)境下。

試驗(yàn)試劑：RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)，Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，SYBR Premix Ex TaqTM II(染料法熒光定量試劑盒)，pMD 19-T Vector Kit(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，大連寶生物工程有限公司；RNase-free水， 北京天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司；Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物技術(shù)有限公司；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，乳酸測定試劑盒，肌/肝糖原測定試劑盒，游離葡萄糖(Glu)，ATP含量測定試劑盒，ADP含量測定試劑盒，AMP含量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；Tris-HCl，D-mannitol(D-甘露糖醇)，美國Amresco公司；EDTA，EGTA，美國Sigma公司；DTT，德國Merck公司；NaF(焦磷酸鈉)，天津永大化學(xué)試劑廠；濃硫酸，NaCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5417R型低溫臺式冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf生物公司；CFX96型實(shí)時定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；BG-power 3500型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Biometra PCR擴(kuò)增儀，北京北方華奧貿(mào)易有限責(zé)任公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1樣品采集和制備

以上述背最長肌(Longissimusdorsi)為試驗(yàn)材料，每頭分別取40 g肉樣，立即放入液氮中，用于0 h樣品，以及AMPK活力、糖酵解指標(biāo)、能量代謝等指標(biāo)進(jìn)行的測定。

將其余背最長肌肉樣每塊迅速切成40 g，于4℃條件下，分別成熟12、24、72、120、168 h，在相應(yīng)時間點(diǎn)測定pH值，以及進(jìn)行AMPK活力、糖酵解指標(biāo)、能量代謝等指標(biāo)的測定。同時，將肉樣在設(shè)計(jì)時間點(diǎn)用液氮迅速冷凍，置于-80℃待測。

宰后1 h內(nèi)取其背最長肌切成約100 mg的小肉塊，立即放入無酶無菌凍存管中，液氮中冷凍，置于-80℃，用于對AMPK基因表達(dá)量的測定。

1.3.2AMPK活性測定

取樣品約0.3 g，按照料液比5 mL/g加入保存于4℃冰箱的冷凍勻漿液，在3 000 r/min的條件下冰浴勻漿，每次勻漿12 s，間隙30 s，連續(xù)5次。然后在4℃、10 000 r/min的條件下冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。AMPK活力的測定步驟以及計(jì)算結(jié)果參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3AMPK基因表達(dá)量的測定

總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄：參照文獻(xiàn)[13]對肌肉中總RNA進(jìn)行提取。RNA樣品于-80℃冰箱中保存。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按Trizol Reagent試劑盒要求提總RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[14]。

引物序列來源及合成：PRKAA1、PRKAA2基因引物序列參照馬曉冰[15]的設(shè)計(jì)。

實(shí)時定量PCR擴(kuò)增：本試驗(yàn)按照CFX96型實(shí)時熒光定量PCR的二步法進(jìn)行操作。以所合成的cDNA為模板，使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增[16]，見表1。

表1 用于實(shí)時熒光定量PCR的引物序列及PCR參數(shù)Tab.1 Primer sequences and parameter used for real-time quantitative PCR

基因相對表達(dá)量的計(jì)算：試驗(yàn)采用文獻(xiàn)[17]的方法對實(shí)時定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，均值差異顯著性采用One-Way ANOVA統(tǒng)計(jì)。采用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3.4糖酵解指標(biāo)的測定

將pH計(jì)的探針插入肉樣中，使pH計(jì)的電極與肌肉組織充分接觸，讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個肉樣重復(fù)測定3次，取平均值。

肌糖原、乳酸、游離葡萄糖含量采用南京建成試劑公司的試劑盒進(jìn)行測定，試驗(yàn)具體操作和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說明進(jìn)行。

1.3.5能量代謝指標(biāo)的測定

參照ATP、ADP、AMP含量測定試劑盒說明書測定其摩爾質(zhì)量濃度，用雙縮脲法測定樣品的蛋白含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)均平行測定3次，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMPK活性

AMPK活性會受到運(yùn)動、缺氧、缺血、應(yīng)激等多種因素的影響[13，15-16，18]，成熟過程中AMPK活力變化如圖1所示，圖中小寫字母表示同一海拔高度牛肉在成熟過程中指標(biāo)的差異顯著(P<0.05)，大寫字母表示不同海拔高度牛肉在每個成熟時間點(diǎn)指標(biāo)的差異顯著(P<0.05)，下同。缺氧條件下，西雜牛AMPK活力均低于甘南牦牛和玉樹牦牛，可能是由于牦牛在低氧條件下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，代謝加強(qiáng)，ATP消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的AMP激活A(yù)MPK。AMPK能夠調(diào)節(jié)動物機(jī)體糖代謝，當(dāng)AMPK活化以后可以通過促進(jìn)糖酵解和糖原分解來提高細(xì)胞的ATP水平，抑制糖原合成和糖異生來阻止ATP的消耗[19]，從而增加ATP含量以維持機(jī)體能量代謝平衡。

圖1 成熟過程中AMPK活力的變化Fig.1 Changes of AMPK activity during conditioning time

2.2 基因表達(dá)量

如圖2所示，玉樹牦牛PRKAA1基因(α1)的表達(dá)量與西門塔爾雜交牛和甘南牦牛相比差異不顯著，甘南牦牛和玉樹牦牛PRKAA2基因(α2)表達(dá)量顯著大于西門塔爾雜交牛(P<0.05)。AMPK在應(yīng)激情況下對調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要作用。AMPK α是最為重要的催化亞基，主要分布在骨骼肌、肝臟和心臟，它出現(xiàn)缺陷或活性降低會直接影響機(jī)體能量調(diào)節(jié)功能，α2亞基在骨豁肌中的表達(dá)要高于α1亞基，含量占總AMPK的80%以上，并且α2亞基有更強(qiáng)的催化效力[17]。當(dāng)機(jī)體處于代謝應(yīng)激時，AMPK往往被激活，活化的AMPK能促進(jìn)外周組織攝取和利用血糖，從而糾正能量代謝的失衡，維護(hù)細(xì)胞和整體代謝穩(wěn)態(tài)的穩(wěn)定，因此AMPK α2亞基對宰后糖酵解過程起到主要調(diào)節(jié)作用。

圖2 AMPK α亞基基因表達(dá)水平Fig.2 Gene expression of α subnits of AMPK

2.3 宰后糖酵解指標(biāo)

pH值的下降主要是由屠宰后乳酸的增加引起的[14]。由表2可看出，剛屠宰時，牛肉的pH值均在6.5～7.0之間，屠宰后由于胴體氧氣供應(yīng)中斷，糖原進(jìn)行無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸，ATP分解后生成磷酸，乳酸、磷酸使肉的pH值下降。但不同種類的動物肌肉在成熟過程中，pH值下降速度存在差異。玉樹牦牛、甘南牦牛和西門塔爾雜交牛成熟至72 h，pH值達(dá)到其極限值，此時pH值在5.53～5.58之間。

在3種海拔高度基因型中，背最長肌的糖原和乳酸含量分別如表2所示。成熟過程中糖原含量快速下降，乳酸含量在宰后24 h前迅速增加(P<0.05)，但宰后72 h的變化速率降低，后趨于穩(wěn)定。玉樹牦牛和甘南牦牛是適應(yīng)低氧水平和寒冷環(huán)境的高海拔品種，有特殊的糖酵解特征。為了適應(yīng)寒冷、高海拔的環(huán)境，玉樹牦牛和甘南牦牛必須有足夠的能量供應(yīng)來維持體溫。無氧代謝(糖酵解)效率低下，每個葡萄糖分子僅產(chǎn)生2個ATP分子，而完全氧化代謝產(chǎn)生38個ATP分子[20]。因此，玉樹牦牛和甘南牦牛必須提高能量產(chǎn)生的效率，從而可以誘導(dǎo)高海拔品種增加氧化代謝和減少無氧代謝[21]。影響宰后糖酵解變化的主要因素有糖原含量，糖原影響游離葡萄糖的含量，通過糖酵解將游離葡萄糖分解成乳酸[22]。為了更好地了解糖酵解差異，進(jìn)一步研究了宰后游離葡萄糖含量(表2)。宰后西雜?？傮w游離葡萄糖含量高于玉樹牦牛和甘南牦牛。與此同時，宰后成熟過程中游離葡萄糖的含量并沒有出現(xiàn)劇烈的上升和下降。根據(jù)結(jié)果表明，當(dāng)糖酵解底物含量足夠時，糖原合成和分解不是影響乳酸含量進(jìn)而改變?nèi)赓|(zhì)的關(guān)鍵因素，因此該機(jī)制解釋了不同品種的肉質(zhì)差異，僅與葡萄糖通過糖酵解分解成乳酸的過程有關(guān)。

表2 宰后牛肉成熟過程中糖酵解指標(biāo)變化Tab.2 Change of yak skeletal muscle quality during conditioning time

隨著宰后成熟的進(jìn)行，ATP逐漸耗盡，肌肉缺少能量控制，肌肉組織開始失控瓦解，解僵開始[23]。在低氧條件下，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，代謝加強(qiáng)，三磷酸腺苷(ATP)消耗增加，ATP的濃度水平降低，AMP生成量增加，高濃度的5′-AMP和AMPK相互作用，激活A(yù)MPK[1,24]。AMPK激活的過程中伴隨ADP、AMP含量的降低。如表3所示，不同海拔高度牛肉宰后ADP的消耗總體都呈現(xiàn)顯著的下降趨勢(P<0.05)，低海拔的西雜牛ADP含量始終較高。

3 結(jié)束語

通過測定玉樹牦牛(海拔4 500 m)、甘南牦牛(海拔3 000 m)和西門塔爾雜交肉牛(海拔1 500 m)宰后成熟過程中牛肉AMPK活性、AMPK基因(PRKAA1、PRKAA2)mRNA表達(dá)量、糖酵解和能量代謝的變化可以得出，高海拔地區(qū)AMPK的活性高于低海拔地區(qū)，并且高海拔地區(qū)條件下PRKAA1和PRKAA2基因表達(dá)量均高于低海拔條件下。這說明PRKAA1以及PRKAA2基因表達(dá)量升高會使AMPK的活性增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路，使糖酵解活性增加，從而促進(jìn)糖酵解進(jìn)程，產(chǎn)生大量乳酸，進(jìn)而導(dǎo)致宰后動物肌肉的能量代謝降低。因此，高海拔、低氧適應(yīng)性下牛肉AMPK的活性增加，從而加快糖酵解代謝，有效調(diào)節(jié)能量的生成，為建立宰后牦牛肉能量代謝理論體系奠定了一定基礎(chǔ)。

表3 宰后牛肉成熟過程中能量代謝指標(biāo)變化Tab.3 Change of yak skeletal muscle energy metabolism during conditioning time mmol/g