譚美玉 田曉宇 姚怡婷 張駿 盛慧明 徐偉紅(通訊作者)

（1上海市同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科 上海 200050）

（2華山醫(yī)院消化病研究所 上海 200041）

瘦素（leptin）是一種主要由脂肪細(xì)胞制成的激素，有助于通過(guò)抑制饑餓來(lái)調(diào)節(jié)能量平衡[1]。雖然脂肪儲(chǔ)存的調(diào)節(jié)被認(rèn)為是瘦素的主要功能，但它也在其他生理過(guò)程中發(fā)揮作用，包括自身免疫、糖尿病的發(fā)生與調(diào)節(jié)[2]。目前關(guān)于瘦素及其受體對(duì)胰腺癌影響的研究較少，本文就瘦素功能性受體Ob-Rb的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響展開研究，詳述如下。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1（CRL-1469，ATCC，USA）保存于DMEM培養(yǎng)基中（Sigma，USA），治療前將胰腺癌細(xì)胞血清饑餓16小時(shí)，然后用100ng/mL人瘦素（Q6NT58，R&D Systems，USA）處理。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）

使用RNA抽提試劑盒（PureLink，Thermo Fisher，USA）提取細(xì)胞總RNA，使用cDNA合成試劑盒（RK20400，ABclonal，USA）合成第一鏈，后用FastQuant RT試劑盒（KR106，TIANGEN，北京）以合成的cDNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)Ob-Rb的mRNA表達(dá)情況。

1.3 蛋白印跡（Western Blot，WB）實(shí)驗(yàn)

使用裂解液+10μL苯甲基磺酰氟（PMSF）將細(xì)胞裂解，離心（4℃，10000rpm，5min）取上清液，使用考馬斯亮藍(lán)（Bradford）法[3]檢測(cè)蛋白含量后，使用SDS-PAGE電泳分離蛋白并通過(guò)轉(zhuǎn)膜將其印跡到PVDF膜上，用SuperBlock封閉緩沖液（Thermo Scientific，USA）封閉后，用Ob-Rb抗體（Proteintech Group，USA）孵育，化學(xué)顯影探測(cè)印跡[4]。

1.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

使用細(xì)胞劃痕測(cè)定法（wound-healing assay）測(cè)量，每組重復(fù)五次取平均數(shù)。先在12孔板后畫橫線標(biāo)記，將胰腺癌細(xì)胞消化后接種入12孔板鋪滿板底，用無(wú)菌槍頭尖端刮擦使匯合的細(xì)胞單層受傷，后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞以除去劃擦產(chǎn)生的碎片，加入瘦素處理。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6小時(shí)檢查平板并使用相差顯微鏡拍照，通過(guò)計(jì)數(shù)遷移到傷口中的細(xì)胞數(shù)量來(lái)定量細(xì)胞遷移，未用瘦素處理的細(xì)胞作為對(duì)照[5]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)資料利用SPSS24.0先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性且組間方差齊，我們采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，反之則考慮非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析方法，分析Ob-Rb表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞遷移的相關(guān)性；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

2.1 胰腺癌細(xì)胞中Ob-Rb表達(dá)情況

Ob-Rb全長(zhǎng)1071bp，WB顯示Ob-Rb識(shí)別瘦素蛋白受體的抗體。

圖1 胰腺癌細(xì)胞中Ob-Rb表達(dá)情況

2.2 Ob-Rb對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響

瘦素處理后，胰腺癌細(xì)胞相對(duì)遷移距離明顯長(zhǎng)于未用瘦素處理的胰腺癌細(xì)胞（P＜0.05）；Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，r=0.623，P＜0.05。

圖2 Ob-Rb對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響

3.討論

當(dāng)胰腺中的細(xì)胞繁殖失控并形成腫塊時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)胰腺癌，它是所有胃腸癌中最惡性腫瘤之一，這些癌細(xì)胞具有侵染全身其他各部位的能力，因此具有低于6%的5年生存率。目前胰腺癌缺乏有效的治療方法，在過(guò)去的幾十年中，沒(méi)有一種新方法能夠幫助患者擺脫疾病或者增加生存幾率[6]。有研究顯示，肥胖和糖尿病是罹患胰腺癌獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)肥胖也與切除胰腺的胰腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。瘦素及其受體的失調(diào)對(duì)其他癌癥（包括胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌等）的影響已有諸多報(bào)道，但瘦素及其受體表達(dá)水平與癌癥之間的關(guān)系尚缺乏詳細(xì)研究[8,9]。

本文研究發(fā)現(xiàn)，Ob-Rb全長(zhǎng)1071bp，WB顯示Ob-Rb識(shí)別瘦素蛋白受體的抗體，說(shuō)明Ob-Rb能在胰腺細(xì)胞中表達(dá)，且是負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能性受體。瘦素處理后，胰腺癌細(xì)胞相對(duì)遷移距離明顯長(zhǎng)于未用瘦素處理的胰腺癌細(xì)胞，且Ob-Rb表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞遷移距離之間Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示P值＜0.05，說(shuō)明Ob-Rb表達(dá)能顯著增加胰腺癌細(xì)胞遷移距離。在癌細(xì)胞中Ob-Rb的異常表達(dá)已被建議是在卵巢癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌一個(gè)有用的預(yù)后標(biāo)志物，雖然所對(duì)應(yīng)病癥不同，但其與本研究發(fā)現(xiàn)的作用結(jié)果一致[10]。

本研究這些發(fā)現(xiàn)為瘦素/Ob-Rb作為胰腺癌新型治療靶點(diǎn)的提供了支持。但本研究的局限性在于，由于瘦素的分泌性質(zhì)，我們沒(méi)有在胰腺癌組織中使用免疫組織化學(xué)同時(shí)測(cè)試瘦素表達(dá)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要確定瘦素及其受體對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用是通過(guò)什么分泌方式發(fā)揮。

綜上所述，瘦素功能性受體Ob-Rb能在人胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)，瘦素處理能增加胰腺癌細(xì)胞遷移距離且Ob-Rb表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞遷移。