□ 靳志敏 王燕 王茹 鄭玉山 張宏博（通訊作者） 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心

1 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類細菌性食物中毒及奶牛乳房炎癥的重要細菌之一[1]。在顯微鏡下,金黃色葡萄球菌呈球狀，直徑約0.8μm，其細胞既沒有芽孢也沒有鞭毛，但少部分會有莢膜；在平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1～2mm。金黃色葡萄球菌的生長條件簡單，可在沒有水的條件下存活幾周，屬于需氧或兼性厭氧微生物，其在普通培養(yǎng)基上就可以生長，最適宜生長的pH值為7.4；最適生長溫度為37℃，溫度過高會使金黃色葡萄球菌死亡[2]。

金黃色葡萄球菌容易引發(fā)大規(guī)模食物中毒，在造成經(jīng)濟損失的同時產(chǎn)生嚴重的社會影響[3]。在乳及乳制品中，可能由于奶?；加腥榉垦装Y等原因而易發(fā)生金黃色葡萄球菌污染現(xiàn)象。所以本實驗對內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的家養(yǎng)獨立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳，以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌的含量進行檢測，判斷其制品的質(zhì)量是否合格。

2 材料與方法

2.1 樣品

圖1 呼市地區(qū)周邊旗縣采樣分布圖

樣品包括現(xiàn)擠生鮮牛乳（散裝）、自制酸乳、自制冰淇淋3類，均來自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特周邊旗縣村散養(yǎng)養(yǎng)殖戶家中，共計20戶，地區(qū)分布如圖1。樣品冷凍或冷藏保存，且在8小時內(nèi)送達實驗室進行檢驗。

實驗選擇樣品作為實驗組，將1mL金黃色葡萄球菌原液加入到25mL無菌水作為陽性對照組，無菌水為陰性對照組。

2.2 實驗方法

2.2.1 檢測方法

參考《國標食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌》GB 4789.10-2016對樣品進行金黃色葡萄球菌檢測。牛乳、自制酸奶各取25mL，冰淇淋雪糕則用電子天平取25g，將樣品放入裝有225mL 0.85%的氯化鈉溶液均質(zhì)袋中，均質(zhì)1分鐘后得到1:10的均勻樣液。用移液器吸取制好的均勻樣液1mL，加入至9mL氯化鈉溶液的鹽水管中，充分震蕩，或用移液槍反復吸取，使其充分混勻后制成-2級樣品勻液；重復上述步驟，將樣品稀釋到-4、-5、-6、-7級（每次吸取完上一級樣品勻液后需更換移液器的槍頭以防止梯度不準）。將稀釋好的每一個梯度樣品勻液吸取1mL，加入到接種量分別為0.3mL、0.3mL和0.4mL的B-P（Baird-Parker）平板中，加入后用無菌涂布棒涂布整個B-P板，涂布過程需防止將培養(yǎng)基刮破，注意不要碰到培養(yǎng)基邊緣[4]。涂布過程中B-P板最好有一定余溫，這樣可以使樣液被平板更好吸收。當B-P平板表面沒有明顯樣液時，涂布完成；將平板靜置10分鐘后，倒置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后取出觀察是否有菌落生長。若有數(shù)據(jù)，需保存好數(shù)據(jù)并準備滅菌殺毒；若沒有，可直接放入生物垃圾袋等待滅菌殺毒。

2.2.2 驗證方法

在觀察過程中若有典型的金黃色葡萄球菌落生成則要進行驗證實驗。

①革蘭氏染色實驗：利用已經(jīng)制好的結(jié)晶紫溶液、革蘭氏碘液以及沙黃對在B-P板上長出的典型菌落進行染色。首先將典型的菌落制成涂片放到顯微鏡上，滴幾滴結(jié)晶紫溶液，一分鐘后用水洗掉；然后滴加革蘭氏碘液，讓其在涂片上停留作用一分鐘后水洗[5]；接著用乙醇進行褪色處理，一般30秒即可，直到完全洗掉，但不能太過脫色，之后用水清洗；最后，滴加上沙黃復染液，約一分鐘后水洗，晾干后進行鏡檢[6]。

②血漿凝固酶實驗：將每個長菌B-P平板上典型的金黃色葡萄球菌菌落都接到BHI與營養(yǎng)瓊脂的小斜面試管中，在37℃下培養(yǎng)18h。將凍干兔血漿加水溶解后，向瓶中加入0.3mL培養(yǎng)過的BHI（腦心浸出液肉湯），充分震蕩，放在36℃下培養(yǎng)，每隔半個小時觀察一次，并持續(xù)觀察6個小時，如果有凝固或者凝固的體積比原來的體積大一半，則可以判斷為陽性的結(jié)果，菌落為金黃色葡萄球菌[7]。

若對結(jié)果還存有疑慮，可挑選經(jīng)過小斜面培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌落于BHI中，在37℃下培養(yǎng)18h，再次重復上述過程。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測結(jié)果

實驗組中生鮮牛乳在36℃下培養(yǎng)48小時后，結(jié)果如表1所示（因為樣品實驗后結(jié)果完全相同，故只取其中5組數(shù)據(jù)舉例分析，下同），菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖2可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質(zhì)合格。

表1 生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)

圖2 48h培養(yǎng)生鮮牛乳中金黃色葡萄球菌B-P平板生長圖

實驗組中，自制酸奶在36℃下培養(yǎng)48小時后，結(jié)果如表2所示，菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖3可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測的樣品均品質(zhì)合格。

表2 自制酸奶中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)

圖3 48h培養(yǎng)自制酸奶中金黃色葡萄球菌B-P平板生長圖

實驗組中，冰淇淋雪糕于36℃下培養(yǎng)48小時后，結(jié)果如表3所示，菌落數(shù)量為0cfu/g，且由圖4可以看出B-P板上未出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落，表明檢測樣品的品質(zhì)均合格。

表3 冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)

圖4 48h培養(yǎng)冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌B-P平板生長圖

陽性對照組實驗中，B-P板上有菌落生長如圖5所示，結(jié)果如表4。經(jīng)計算，金黃色葡萄球菌數(shù)量為4.9×108cfu/g。

表4 陽性對照組中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)

圖5 48h培養(yǎng)陽性對照組中金黃色葡萄球菌B-P平板生長圖

陰性對照組中，由圖6可以看出B-P平板沒有金黃色葡萄球菌菌落生成，結(jié)果如表5，證明實驗沒有被污染，實驗成功。

表5 陰性對照組中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)

圖6 陰性對照組金黃色葡萄球菌B-P平板生長圖

3.2 驗證結(jié)果

對陽性對照組B-P板上的菌落進行革蘭氏染色實驗，染色實驗現(xiàn)象如圖7所示，排列呈葡萄球狀、無芽胞、無莢膜、直徑約為0.5～1μm。驗證該微生物為金黃色葡萄球菌，驗證成功。

圖7 革蘭氏染色后的金黃色葡萄球菌

圖8 營養(yǎng)瓊脂小斜面上菌落生長情況

將B-P板上生長出的黑色小點沾取一點，然后在營養(yǎng)瓊脂小斜面輕輕上劃線，培養(yǎng)后均如圖8所示，圖中透明無色的部分為生長出的菌落，驗證成功，黑色小點是一種微生物菌落。

將B-P板上長出的菌加入到BHI培養(yǎng)液做血漿凝固酶實驗，本次血漿凝固酶實驗均用凍干兔血漿，加500mL無菌水溶解后加入0.3mL的BHI培養(yǎng)液，血漿凝固酶實驗結(jié)果如圖9所示，圖中左側(cè)為金黃色葡萄球菌陽性菌，右側(cè)為陰性對照實驗，左側(cè)瓶中出現(xiàn)凝固，結(jié)果為陽性，表明該微生物為金黃色葡萄球菌。

4 結(jié)論

本實驗對呼和浩特市郊區(qū)普通農(nóng)戶的家養(yǎng)獨立奶牛所產(chǎn)生鮮牛乳以及自制酸乳和冰淇淋雪糕中金黃色葡萄球菌進行檢測，結(jié)果顯示，3種自制產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)為0cfu/g，表明產(chǎn)品中均不含有金黃色葡萄球菌，品質(zhì)合格。

圖9 血漿凝固酶實驗對比圖

本次實驗對呼和浩特市市郊20戶散養(yǎng)養(yǎng)殖戶的生鮮牛乳及乳制品的檢測中未發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌，說明呼市散養(yǎng)養(yǎng)殖戶家生產(chǎn)的生鮮牛乳及乳制品符合食品安全規(guī)范。但是由于樣本量較少，仍不足以說明全部地區(qū)都符合安全標準。對于金黃色葡萄球菌的檢測是必不可少的，企業(yè)和監(jiān)管部門一定要足夠重視食品安全，并時刻關注金黃色葡萄球菌的檢測發(fā)展。

論文征稿函

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