史雪霞 李運

中圖分類號 R917；R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2389-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.20

摘 要 目的：建立同時測定硫磺熏蒸前后當歸中阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A等7種活性成分含量的方法。方法：采用超高效液相色譜法。色譜柱為Waters BEH C18，流動相為1%醋酸-甲醇（梯度洗脫），柱溫為30 ℃，流速為0.35 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣量為2 μL。結(jié)果：阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A檢測進樣量的線性范圍分別為0.021 6～0.324 0、0.327 2～4.908 0、0.011 51～0.172 7、0.055 0～0.825 0、0.002 248～0.033 72、0.007 2～0.108、 0.001 08～0.016 2 μg（r2=0.999 1～1.000 0）；檢測限分別為3.7、0.56、0.52、2.02、0.007 6、1.16、0.64 ng；定量限分別為11.5、1.85、1.66、6.26、0.076、3.36、1.79 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD均<3.0%（n=6）；7種成分平均加樣回收率為95.79%～101.70%，RSD為2.10%～2.93%（n=6）。硫磺熏蒸后對當歸中7種活性成分含量的影響較大，總體呈下降趨勢。結(jié)論：本研究建立的方法的精密度、穩(wěn)定性、重復性均較好，可用于硫磺熏蒸前后當歸中7種活性成分的含量測定；硫磺熏蒸后會降低當歸中活性成分的含量。

關(guān)鍵詞 當歸；硫磺熏蒸；超高效液相色譜法；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 7 kinds of active components that as ferulic acid， ligustilide， n-butylidenephthalide， senkyunolide A， senkyunolide H， senkyunolide I and levistilide A in Angelica sinensis before and after sulfur fumigation simultaneously. METHODS： UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters BEH C18 column with mobile phase consisted of 1%acetic acid-methanol （gradient elution） at flow rate of 0.35 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was set at 254 nm. The sample size was 2 μL. RESULTS： The linear range for ferulic acid， ligustilide， n-butylidenephthalide， senkyunolide A， senkyunolide H， senkyunolide I and levistilide A was 0.021 6-0.324 0， 0.327 2-4.908 0， 0.011 51-0.172 7， 0.055 0-0.825 0， 0.002 248-0.033 72， 0.007 2-0.108， 0.001 08-0.016 2 μg （r2= 0.999 1-1.000 0）， respectively. The limits of detection were 3.7， 0.56， 0.52， 2.02， 0.007 6， 1.16， 0.64 ng， respectively. The limits of quantitation were 11.5， 1.85， 1.66， 6.26， 0.076， 3.36， 1.79 ng， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were lower than 3.0% （n=6）. The average recovery rates of 7 kinds of active components were from 95.79% to 101.70% （RSD=2.10%-2.93%， n=6）. The contents of active 7 kinds of active components in A. sinensis were greatly influenced by sulfur fumigation and had a downward trend in general. CONCLUSIONS： The established method is simple with good precision，stability and reproducibility and can be used for the content determination of 7 kinds of active components in A. sinensis before and after sulfur fumigation. The sulfur fumigation will decrease the contents of active components in A. sinensis.

KEYWORDS Angelica sinensis； Sulfur fumigation； UPLC； Content determination

當歸為傘形科植物當歸[Angelica sinensis（o1iv.）Diels]的干燥根，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品。當歸藥材在貯藏過程中較易生蟲，且顏色逐漸變暗。傳統(tǒng)的產(chǎn)地加工方法為秋季采挖，除去須根和泥沙，待水分稍蒸發(fā)后，捆成小把，上棚，用煙火慢慢熏干[1]。根據(jù)產(chǎn)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，為了便于藥材貯藏過程中的干燥、防蟲、防霉，產(chǎn)地尚存在硫磺熏蒸現(xiàn)象。但是近年來硫磺熏蒸引起了人們的異議，認為過度硫磺熏蒸可使中藥材中的某些生物活性物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)或含量發(fā)生改變，進而對其內(nèi)在質(zhì)量產(chǎn)生影響，并產(chǎn)生有害的外源性物質(zhì)（如二氧化硫等）[2-6]。雖然2015年版《中國藥典》（四部）通則0212項下對中藥材及飲片中二氧化硫殘留量進行了規(guī)定，且國內(nèi)有學者對硫磺熏蒸當歸藥材后含硫量和阿魏酸的含量變化進行了研究[7-8]，但未見硫磺熏蒸前后當歸中多種化學成分含量變化研究的報道。因過度硫磺熏蒸可導致中藥材中有效成分變化，進而對中藥材的質(zhì)量產(chǎn)生影響，故值得深入研究。

已有諸多文獻采用高效液相色譜（HPLC）法、傅里葉變換紅外光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜或液相質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)檢測硫磺熏蒸前后當歸中阿魏酸、揮發(fā)油等成分的變化情況[8-13]。張永等[14]對甘肅當歸炮制前后HPLC特征圖譜及阿魏酸含量進行了測定，楊英來等[15]對當歸補氣活性部位的HPLC特征圖譜與其補氣功效的相關(guān)性進行了研究，通過藥理實驗與灰色關(guān)聯(lián)度統(tǒng)計方法，初步確定了當歸醇提物中各組分對補氣作用的貢獻大小，并對其中的阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I及歐當歸內(nèi)酯A 7種成分進行了歸屬。宮文霞等[16]對逍遙散中當歸的抗抑郁活性成分進行了研究，并篩選出丁烯基苯酞、藁本內(nèi)酯等為潛在的抗抑郁活性成分。本研究擬以當歸中所含阿魏酸等7種活性成分為研究對象，建立一種快速、高效的液相色譜檢測方法，用于當歸藥材中多種化學成分的含量測定，并比較硫磺熏蒸前后化學成分含量的變化，為該藥材的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Acquity超高效液相色譜（UPLC）儀，包括ACQ- QSM四元泵、ACQ-FTN自動進樣器、ACQ-PDA檢測器、Empower3色譜工作站（美國Waters公司）；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國艾卡公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BSA224S-CW萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q advantage A 10超純水系統(tǒng)[德國默克化工技術(shù)（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

當歸藥材于2012年10-12月采自甘肅、四川和云南等不同地區(qū)，共25批，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院晉玲教授鑒定為當歸的干燥根（具體來源見表1）；阿魏酸對照品（批號：110773-201614）、藁本內(nèi)酯對照品（批號：111737-201608）和歐當歸內(nèi)酯A對照品（批號：111826- 201605）均購自中國食品藥品檢定研究院（純度：均>98%）；丁烯基苯酞對照品（批號：YL2013020907）、洋川芎內(nèi)酯A對照品（批號：YL2013021705）、洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號：YL2013020301）、洋川芎內(nèi)酯I對照品（批號：YL2013021501）均購自上海一林生物科技有限公司（純度：均>98%）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.10 mm，1.7 ?m）；流動相：1%醋酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～4.34 min，5%～50%B；4.34～6.72 min，50%～70%B；6.72～8.51 min，70%～75%B；8.51～12.08 min，75%～100%B）；流速：0.35 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：2 ?L。

2.2 硫磺熏蒸樣品的制備

分別取表1各編號樣品適量，按0.1%樣品稱取硫磺，密封熏蒸4 h，得到不同產(chǎn)地當歸的硫磺熏蒸樣品[17]，備用。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液 分別取對照品阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A適量，精密稱定，置于不同10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照品貯備液。分別吸取上述7種對照品貯備液，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A質(zhì)量濃度分別為108、1 636、57.57、275、11.24、36、5.4 ?g/mL的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取當歸藥材（熏蒸和未熏蒸）細粉（過三號篩）1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，分別加入10、8 、6倍量70%乙醇，回流提取3次，提取時間依次為60、45、45 min，濾過，合并濾液，蒸干溶劑，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾，即得。

2.3.3 空白溶液 不加藥材，其余操作同“2.3.2”項。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.3”項下混合對照品溶液、供試品（編號S1）溶液以及空白溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結(jié)果，在此色譜條件下，各待測成分間及與雜質(zhì)峰間均能達到基線分離，分離度均大于1.5，其他成分對待測成分的測定無干擾，理論板數(shù)按阿魏酸峰計不低于5 000，色譜圖詳見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.3.1”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、3.0 mL 至 100 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果，各成分在進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)于均良好，結(jié)果詳見表2。

2.6 檢測限與定量限試驗

取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為3 ∶ 1時得檢測限；當信噪比為10 ∶ 1時測得定量限，結(jié)果詳見表2。

2.7 精密度試驗

取S1號產(chǎn)地未經(jīng)硫磺熏蒸的樣品溶液測定日內(nèi)精密度和日間精密度。同一供試品溶液每天連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算日內(nèi)精密度。結(jié)果，阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A峰面積的RSD分別為0.59%、0.44%、1.64%、2.10%、0.84%、0.54%、0.90%（n=6）；取同一供試品溶液，連續(xù)3 d每天進樣測定2次，記錄峰面積并計算日間精密度。結(jié)果，阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A峰面積的RSD分別為1.59%、1.60%、1.44%、1.25%、1.54%、1.75%、1.97%（n=6）。以上結(jié)果表明，本方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品（S1號未經(jīng)硫磺熏蒸樣品）溶液適量，分別于室溫下密閉放置0、2、4、6、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A峰面積的RSD分別為2.01%、1.54%、1.77%、1.15%、1.64%、1.78%、1.98%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗

取S1號未經(jīng)硫磺熏蒸的藥材6份，每份1 g，分別按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果。阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A的平均含量分別為1.164 4、11.049 9、0.776 8、1.102 4、0.167 5、0.724 3、0.058 1 mg/g，RSD分別為2.93%、2.73%、2.86%、2.16%、1.40%、2.64%、2.46%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

以加樣回收率考察準確度。取S1號未經(jīng)硫磺熏蒸的當歸藥材6份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入1 mL新制的混合對照品溶液（阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁烯基苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、歐當歸內(nèi)酯A的質(zhì)量濃度分別為108、1 090.7、57.57、137.5、11.24、72、5.4 ?g/mL），按“2.3.2”項下操作制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算7個成分的加樣回收率。結(jié)果，各待測組分的平均加樣回收率為95.79%～101.70%，RSD為2.10%～2.93%（n=6），表明該法準確度較高，結(jié)果詳見表3。

2.11 樣品含量測定

取25批當歸藥材和相對應的硫磺熏蒸處理的當歸藥材，每批樣品取3份，分別按“2.3.2”項下方法制備樣品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，每份測定3次，結(jié)果詳見表4。

從表4測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的當歸藥材中各成分含量差異較大，這可能與其生長環(huán)境、生長年限和土壤狀況等因素有關(guān)，具體關(guān)聯(lián)還待進一步深入研究。在當歸的加工中，排除個別藥材可能由于硫磺熏蒸不均勻致7種活性成分含量變化不規(guī)律外，產(chǎn)自岷縣茶埠不同海拔的當歸藥材經(jīng)過硫磺熏蒸后，7種活性成分的含量均降低。除岷縣產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地的當歸藥材經(jīng)過硫磺熏蒸后，歐當歸內(nèi)酯A的含量總體呈上升趨勢，而阿魏酸等其余6種活性成分含量總體呈下降趨勢。

3 討論

3.1 樣品提取溶劑及條件的選擇

在前期藥材提取預試驗中，筆者分別以甲醇、乙醇、三氯甲烷、三氯甲烷-乙醇（70 ∶ 30，V/V）為溶劑進行超聲、索氏和回流提取的對比研究。結(jié)果表明，當以70%乙醇回流提取時藥材提取率較高，且綠色環(huán)保。在此基礎(chǔ)上，筆者又進一步考察了提取次數(shù)、提取時間和提取溶劑體積對藥材提取率的影響。結(jié)果表明，當回流提取次數(shù)為3次，3次提取時間分別為60、45、45 min，提取溶劑分別為10、8和6倍體積時藥材提取效率最高，故在本研究中以此條件進行藥材的提取處理。

3.2 流動相的選擇

目前，國內(nèi)關(guān)于同時測定當歸藥材中這7種成分的UPLC分析方法尚未見文獻報道，僅有HPLC法測定當歸藥材中阿魏酸和藁本內(nèi)酯含量的文獻報道，流動相多采用甲醇-磷酸水溶液和乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)[8]。本研究選用4個不同系統(tǒng)的流動相：乙腈-0.1%磷酸、乙腈-1%冰乙酸、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-1%冰醋酸進行測定，同時考察了各系統(tǒng)不同組成比例的流動相對色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，當以甲醇-1%冰醋酸為流動相進行梯度洗脫時，各個指標成分出峰時間適中，各成分間分離度良好，故確定以此為最終的流動相。

3.3 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，考察不同吸收波長下各待測成分的圖譜響應強度，發(fā)現(xiàn)阿魏酸在234.2、322.2 nm波長處紫外吸收較大，藁本內(nèi)酯的最大紫外吸收為280.4 nm，丁烯基苯酞的最大紫外吸收為259.0 nm，洋川芎內(nèi)酯A的最大紫外吸收為281.6 nm，歐當歸內(nèi)酯A的最大紫外吸收為276.9 nm，洋川芎內(nèi)酯H的最大紫外吸收為275.7 nm，洋川芎內(nèi)酯I的最大紫外吸收為275.7 nm。7種活性成分在254 nm波長時均有較強的紫外吸收，故最終確定254 nm為本研究7種活性成分含量測定的檢測波長。

綜上所述，本研究建立了同時測定硫磺熏蒸前后當歸藥材中7種成分含量的方法，該法準確、快速。當歸藥材經(jīng)硫磺熏蒸后，7種活性成分的含量總體呈下降趨勢，表明硫磺熏蒸對當歸藥材中活性成分含量的影響較大。

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（收稿日期：2018-03-19 修回日期：2018-07-03）

（編輯：林 靜）