張煒 宋文靜 馬青青 范瑩瑩 楊鳳梅 駱桂法

中圖分類號(hào) R917；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）17-2381-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.18

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定藏藥潔白丸中沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為CAPCELL PAK MGⅡ C18，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）和280 nm（沒(méi)食子酸、丁香酚），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為46.50～2 325.00、21.28～1 064.00、4.38～219.20、4.17～208.40 μg/mL（r均≥0.999 1），檢測(cè)限分別為0.26、0.09、0.28、0.35 μg/mL，定量限分別為0.74、0.25、0.95、1.06 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（48 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均≤2.0%（n=6或n=7），加樣回收率分別為98.5%、97.6%、97.1%、101.6%，RSD分別為1.4%、1.9%、1.6%、1.7%（n=6）；6批潔白丸樣品中沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量范圍分別為4.28～7.02、1.09～4.90、0.25～0.60、0.30～0.72 mg/g。結(jié)論：建立的方法可用于藏藥潔白丸中沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯含量的同時(shí)測(cè)定。

關(guān)鍵詞 潔白丸；藏藥；含量；沒(méi)食子酸；丁香酚；土木香內(nèi)酯；異土木香內(nèi)酯；高效液相色譜法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in Tibetan medicine Jiebai pills simultaneously. METHODS： HPLC method was adopted. The separation was performed on CAPCELL PAK MGⅡ C18 column with of mobile phase composed of methanol-acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.8 mL/min. The detection wavelengths were 220 nm for alantolatone and isoalantolactone， 280 nm for gallic acid and eugenol. The column temperature was at 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone were 46.50-2 325.00， 21.28-1 064.00， 4.38-219.20 and 4.17-208.40 μg/mL， respectively （all r≥0.999 1）. The limits of detection were 0.26， 0.09， 0.28，0.35 μg/mL， and the limits of quantitation were 0.74， 0.25， 0.95， 1.06 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6 or n=7）. The recoveries were 98.5%， 97.6%， 97.1% and 101.6%， and RSDs were 1.4%， 1.9%， 1.6%， 1.7% （n=6）， respectively. The content of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in 6 batches of Baijie pills were 4.28-7.02， 1.09-4.90， 0.25-0.60， 0.30-0.72 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method can be used for content determination of gallic acid，eugenol，alantolatone and isoalantolactone in Tibetan medicine Jiebai pills simultaneously.

KEYWORDS Jiebai pills； Tibetan medicine； Content； Gallic acid； Eugenol； Alantolatone； Isoalantolactone； HPLC

潔白丸成方于公元14世紀(jì)，出自藏族歷史上著名的大成就者唐東杰布（1385-1464），公元17世紀(jì)達(dá)莫門讓巴·洛桑曲扎將本方收載于其編著的《達(dá)莫·秘籍》中，公元19世紀(jì)貢珠·云丹嘉措編著《寶藏》稱本品為唐東杰布發(fā)明的“白丸”[1]。潔白丸應(yīng)用于藏醫(yī)臨床有近千年的歷史，是治療消化道疾病的經(jīng)典驗(yàn)方，其以確切的療效被流傳至今。20世紀(jì)初，經(jīng)過(guò)一系列的工藝改進(jìn)和完善，演變?yōu)楝F(xiàn)用的“潔白丸”及其他劑型[2]。

潔白丸是健脾和胃、止痛止吐的常用胃藥，主要適用于胃寒疼痛、胸腹脹滿。方中以訶子為主藥，強(qiáng)身壯體，健脾止瀉，調(diào)節(jié)“三因”；輔以溫中和胃、開胃消食、驅(qū)風(fēng)散寒的石榴、木瓜、肉豆蔻、草豆蔻、丁香、草果仁，以治療胃火衰退、胃痛；為了加強(qiáng)止痛止瀉、消除腹脹的作用，又配用了可清熱消炎、止痛止瀉、調(diào)理氣血的寒水石、沉香、紅花、石灰華、五靈脂膏、土木香、翼首草[3-4]。此方既可治療嘔吐泄瀉，又可用于胸腹脹滿，是藏族先民留下來(lái)的難得的治療消化道疾病的良方[5-7]。

經(jīng)查詢國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品數(shù)據(jù)庫(kù)，全國(guó)生產(chǎn)潔白丸及其他劑型的藏藥生產(chǎn)廠家有10余家，除丸劑外，還包括膠囊劑、片劑等?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道多集中于潔白丸的物質(zhì)基礎(chǔ)及臨床功效研究上[4-7]，尚未見(jiàn)對(duì)潔白丸多組分含量測(cè)定的報(bào)道。本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)潔白丸中沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，以期為更科學(xué)、更全面地控制潔白丸的質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 HPLC儀，包括2998光電二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AUW220D電子天平（日本Shimadzu公司）；CPA225D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck公司）；Q250DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）； DK-S16恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

潔白丸（金訶藏藥股份有限公司，批號(hào)：20150402、20160102、20160201、20160202、20160519、20161105，規(guī)格：每丸質(zhì)量0.8 g）；丁香酚對(duì)照品（批號(hào)：110725- 201414，純度：≥98%）、土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110760-201510，純度：≥98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：15061207，純度：≥98%）、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：13041108，純度：≥98%）均購(gòu)自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，梯度洗脫；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）、280 nm（沒(méi)食子酸、丁香酚）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制成沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為2.325、1.064、0.219、0.208 mg/mL的混合溶液，作為混合對(duì)照品貯備溶液。精密吸取上述溶液加甲醇稀釋10倍，制成質(zhì)量濃度分別為232.5、106.4、21.9、20.8 μg/mL的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取潔白丸樣品，研成細(xì)粉；精密稱取1.0 g，置于100 mL錐形瓶中；精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，85 ℃加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按潔白丸的處方配比，除去訶子、丁香、土木香制成陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成潔白丸陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，在該色譜條件下，沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯在各自檢測(cè)波長(zhǎng)下均與其他成分完全分離，各成分色譜峰之間及與相鄰色譜峰之間分離度均>1.5，其他成分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。理論板數(shù)以沒(méi)食子酸峰計(jì)不低于3 000，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得到4種成分的線性范圍及回歸方程，結(jié)果表明，4種成分在各進(jìn)樣范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，每次10 μL，記錄峰面積。結(jié)果，沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、0.7%、1.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取潔白丸樣品（批號(hào)：20160519），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、2.0%、1.5%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取潔白丸樣品（批號(hào)：20160519）粉末1.0 g，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.7%、1.2%、1.8%、1.9%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取潔白丸樣品（批號(hào)：20160519）0.5 g，平行6份，分別加入約與樣品中沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯4種成分含量相同的4種對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯的平均加樣回收率分別為98.5%、97.6%、97.1%、101.6%，RSD分別為1.4%、1.9%、1.6%、1.7%（n=6），結(jié)果詳見(jiàn)表3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果詳見(jiàn)表4。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

以沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯4種成分的提取率為指標(biāo)，分別對(duì)超聲波提取和加熱回流提取方法、甲醇和乙腈兩種提取溶劑、50%～100%的提取溶劑（甲醇和乙腈）質(zhì)量分?jǐn)?shù)、30～60 min的提取時(shí)間及提取溶劑的量（25和50 mL）進(jìn)行綜合交叉考察。結(jié)果顯示，以25 mL的純甲醇加熱回流提取60 min所得供試品中4種待測(cè)成分的提取率最高。

3.2 流動(dòng)相和流速的選擇

由于待測(cè)成分極性差異較大，且部分成分呈酸性，故首選酸性流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫。本試驗(yàn)考察了甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液和甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液，結(jié)果顯示，甲醇-乙腈-0.2%磷酸溶液分離效果最佳，僅使用乙腈-0.2%磷酸溶液的情況下，沒(méi)食子酸出峰時(shí)間較早，分離度不佳；而僅使用甲醇-0.2%磷酸溶液的情況下，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯無(wú)法完全分離。在試驗(yàn)過(guò)程中筆者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用0.8 mL/min的流速時(shí)，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯這2種成分的分離效果比1.0 mL/min的流速時(shí)進(jìn)一步提高。因此，最終以甲醇-乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.8 mL/min[8]。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，沒(méi)食子酸的吸收波長(zhǎng)λmax為270 nm[9]，丁香酚λmax為280 nm[10]，土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯λmax為220 nm[11-12]。本試驗(yàn)使用的HPLC儀配備了全波長(zhǎng)DAD，在220 nm波長(zhǎng)下已能檢測(cè)出4種待測(cè)成分的色譜峰，但沒(méi)食子酸在220 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下相比280 nm響應(yīng)值低4～5倍，同時(shí)存在部分低波長(zhǎng)雜質(zhì)峰干擾；綜合考慮4種成分色譜峰對(duì)稱因子、分離度、響應(yīng)值、基線噪音，以及檢測(cè)方法對(duì)各含量范圍樣品的適用性、靈敏度等因素后，為了測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，最終確定建立220、280 nm雙通道分別檢測(cè)。

3.4 小結(jié)

潔白丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[13]，含量測(cè)定指標(biāo)僅為沒(méi)食子酸。筆者查閱文獻(xiàn)，針對(duì)潔白丸的研究多為臨床療效方面，未見(jiàn)采用其他指標(biāo)成分對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行控制。本文所選擇的指標(biāo)成分沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯，是潔白丸處方中訶子、丁香、土木香多個(gè)藥味的有效成分[14-16]，并非來(lái)源于某單一藥味，故選取這4種成分進(jìn)行檢測(cè)更能完全反映藥物的內(nèi)在質(zhì)量。本試驗(yàn)首次建立了一種快速、準(zhǔn)確的HPLC-DAD雙通道分析方法，用于同時(shí)測(cè)定藏成藥潔白丸中4種活性成分（沒(méi)食子酸、丁香酚、土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）的含量，與各成分單獨(dú)測(cè)定含量[17-19]比較，該方法分析時(shí)間更短、效率更高；同時(shí)，使用的有機(jī)溶劑消耗更少，在降低成本的同時(shí)還減少了環(huán)境污染[20]。該方法成功檢測(cè)了6批市售樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)已控制的指標(biāo)成分沒(méi)食子酸結(jié)果較為穩(wěn)定外，其他3種成分測(cè)定結(jié)果最高值約為最低值的2～4倍（丁香酚：1.09～4.90 mg/g；土木香內(nèi)酯：0.25～0.60 mg/g；異土木香內(nèi)酯：0.30～0.72 mg/g），提示潔白丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及生產(chǎn)工藝還需進(jìn)一步完善，以便提高對(duì)丁香、土木香等揮發(fā)性藥味在制劑中的質(zhì)量均一性。本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，方法學(xué)考察結(jié)果良好，可以為藏成藥潔白丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)制訂提供依據(jù)。

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[20] 康慧，劉亞蓉. HPLC法同時(shí)測(cè)定六味能消丸中8種成分的含量[J].中國(guó)藥房，2017，28（24）：3433-3436.

（收稿日期：2018-05-21 修回日期：2018-07-17）

（編輯：余慶華）