首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院（100038）李素云 吉琳琳

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所（300050）李素云 高蔚娜 郭長江

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所（100850）李崢 張振清

槲皮素及其糖苷衍生物是一類廣泛存在于植物性藥物和食物中的黃酮化合物之一[1]，普遍存在于水果、蔬菜、茶葉及中草藥中，是黃酮家族中重要的成員，具有多樣的生物學(xué)效應(yīng)，如抗氧化、抗炎癥反應(yīng)、抗肥胖、抗生物膜及抗腫瘤等活性[2]。槲皮素及其糖苷衍生物在腸道吸收過程中即發(fā)生廣泛的代謝，門靜脈中幾乎檢測不到原形的存在，其中甲基化反應(yīng)是其最基本的代謝形式，進一步的葡糖糖醛酸化和/或硫酸化使其代謝產(chǎn)物眾多、數(shù)量極少、難于定性和定量[3]，且由于槲皮素在自然環(huán)境下極不穩(wěn)定，易被氧化，因此，槲皮素及其代謝產(chǎn)物的分析成為槲皮素及其糖苷衍生物研究中的難點之一。目前，槲皮素及其糖苷衍生物和相關(guān)代謝產(chǎn)物主要采用HPLC、HPLC-MS/MS等分析方法，但樣品處理方法復(fù)雜，對槲皮素及其代謝產(chǎn)物的影響不易評估。筆者參考國內(nèi)外有關(guān)文獻，建立了HPLC-MS檢測法，可同時測定槲皮素及其甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素，并初步應(yīng)用于細胞培養(yǎng)條件下的樣品測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（SANYO，日本）；倒置電子顯微鏡（Olympus，日本）；萬分之一電子天平（BS 110S），北京賽多利斯天平有限公司；Agilent 1100 LC/MSD SL 型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent，美國)；Milli-Q Gradient A10超純水器(Millipore Inc.美國)。

丁螺環(huán)酮(buspirone，內(nèi)標(biāo)，批號0803021，純度99.9%)北京華素制藥股份有限公司提供；槲皮素（quercetin）、異鼠李亭（isorhamnetin）；檉柳黃素（tamarixetin）、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；色譜純甲醇（美國Fisher公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；胎牛血清、非必需氨基酸（美國Hyclone公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

附圖1 槲皮素及其甲基代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC-MS標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

附圖2 槲皮素在Caco-2細胞單層上A→B跨膜轉(zhuǎn)運中B側(cè)溶液中HPLC-MS檢測色譜圖

1.2 高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）分析

1.2.1 色譜條件：選擇Agilent-C18色譜柱(2.1mm×100mm，3.5μm)；柱溫為室溫；流動相為甲醇∶乙腈（1∶1），含0.1%甲酸；流速為0.2ml/min，進樣量為20μl。

1.2.2 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，霧化氣壓力30psi，干燥氣流速8L/min，干燥氣溫度35℃，毛細管壓力為3000V，四極桿溫度99℃，增益為1，峰寬為0.10min，正離子模式，采用選擇離子監(jiān)測（SIM）。槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的m/z分別為303、317和317，丁螺環(huán)酮（內(nèi)標(biāo)）為386.2。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：精確稱取槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素標(biāo)準(zhǔn)品，溶劑為DMSO，配制濃度為3.0mg/ml的母液，取等量槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素母液混合，漩渦震蕩使充分混勻，再配制成濃度為1.0mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液配制：用采樣器精確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用磷酸緩沖液（PBS溶液）配制成2.0、4.0、10.0、20.0、40.0、100、200、400、1000、2000、4000μg/L，作為混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。同時用PBS溶液配制濃度為18μg/L的槲皮素溶液，作為細胞孵育液備用。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精確稱取丁螺環(huán)酮5mg，用乙腈配制成1.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用流動相稀釋為20μg/L，作為標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液備用。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確量取上述各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液和內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各200μl，漩渦振蕩30s使充分混合，3000r/min離心3min，取上清液，20μl進樣，LC/MS測定。以各標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮的峰高比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 細胞培養(yǎng)條件和方法Caco-2細胞株購自ATCC，代數(shù)在40～50代之間，采用DMEM高糖培養(yǎng)基（10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺及青霉素-鏈霉素雙抗液）、置于37℃、5%CO2、90%相對濕度下培養(yǎng)。

1.3 細胞培養(yǎng)樣品制備與測定 實驗前以37℃PBS液（pH7.2）浸泡接種在12孔Millicell板上的細胞15min，輕微沖洗除去細胞表面附著物。在頂側(cè)（A）加入濃度為18μg/L的槲皮素溶液600μl，基底側(cè)（B）加入空白PBS液（pH7.2）1200μl，n=3，放入37℃、5%CO2、90%相對濕度的培養(yǎng)箱中孵育150min，于B側(cè)采樣50μl，精確加入等量內(nèi)標(biāo)溶液并充分混勻，20μl直接進樣測定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)譜圖 通過優(yōu)化條件，槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素的保留時間tR分別為2.976min、5.063min、10.951min，丁螺環(huán)酮保留時間tR為1.585min，細胞孵育液中實測樣品各化合物保留時間稍有變化，見附圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素在1.0～1000μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程依次為：Y=0.0209891X+0.002801，r=0.99996；Y=0.0153413X-0.0005867，r=0.99955；Y=0.0175301X-0.0004946，r=0.99983。

附表 槲皮素孵育150min B側(cè)槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的測定(n=3)

2.3 最低檢測限 槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素最低檢測限均為1.0μg/L。

2.4 細胞培養(yǎng)樣品 由附表可知，在目標(biāo)峰保留時間左右，細胞孵育液中無雜質(zhì)峰干擾樣品測定。細胞孵育液測定結(jié)果表明，槲皮素在A→B跨膜轉(zhuǎn)運中，在Caco-2細胞單層基底側(cè)（B），可以檢測到槲皮素原形。同時B側(cè)溶液中可以檢測到槲皮素的甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素。其中，3'-OH位置甲基化產(chǎn)物異鼠李亭約是4'-OH位置甲基化產(chǎn)物檉柳黃素的2倍左右。

3 討論

槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC和HPLC-MS/MS測定方法已有報道，在同一溶液體系中同時測定槲皮苷、槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC-MS方法也有報道[4]。但由于槲皮素為脂溶性，槲皮苷為水溶性，實現(xiàn)同一體系中同時測定二者的同時，也會損失槲皮素的測定精度。文獻報道，槲皮素在腸道吸收和代謝過程中會發(fā)生脫糖基和進一步的代謝反應(yīng)，如甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化等反應(yīng)。但由于槲皮素在體外環(huán)境中不穩(wěn)定，在有氧條件下極易發(fā)生氧化等反應(yīng)[5]，因此，實驗樣品在檢測前的處理方法會對測定結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。以往文獻中測定槲皮素及其甲基代謝產(chǎn)物一般采用結(jié)構(gòu)相似的類黃酮物質(zhì)做內(nèi)標(biāo)[6]，但類黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，體外環(huán)境下易氧化降解，因此，選擇一個穩(wěn)定的內(nèi)標(biāo)對考察槲皮素及其代謝產(chǎn)物的含量很重要。丁螺環(huán)酮在常溫下穩(wěn)定，室溫下放置72小時、4℃放置1周，測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過5%，與文獻報道一致[7]。因此，本實驗采用丁螺環(huán)酮做內(nèi)標(biāo)，解決了同類物質(zhì)不穩(wěn)定對實驗結(jié)果的影響，在此基礎(chǔ)上建立了可以同時測定細胞培養(yǎng)體系中上述3種化合物的HPLC-MS定量檢測方法。

本研究選擇Agilent-C18色譜柱（2.1mm×100mm，3.5μm），并考察了不同流動相體系對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇+乙腈（1∶1）[8]等流動相體系中，三種化合物和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)均分離良好，但在甲醇+乙腈（1∶1）流動相體系中干擾較小，ESI離子化效果較好，因此流動相選擇甲醇+乙腈（1∶1）。

本研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李亭和檉柳黃素在正、負離子監(jiān)測模式下離子化效率均佳，槲皮素和丁螺環(huán)酮在正離子檢測模式下離子化效率優(yōu)于負離子檢測，因此選擇正離子檢測。在ESI(+)離子化方式下，槲皮素、異鼠李亭、檉柳黃素生成的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z303、m/z317和m/z317，丁螺環(huán)酮為386.2。

在以往的研究中，樣品處理大多選用提取、揮干、復(fù)溶或酶解等方式，以達到提高待測樣品濃度的目的。但由于槲皮素及其代謝化產(chǎn)物物特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在體外環(huán)境下極不穩(wěn)定，給樣品處理造成極大困難，同時由于槲皮素的大部分代謝產(chǎn)物均沒有標(biāo)準(zhǔn)品，且含量甚微，因此樣品處理過程對研究結(jié)果的影響很大。

本方法采用細胞培養(yǎng)液經(jīng)一倍稀釋直接進樣測定，不僅使樣品處理更簡單易行，同時也減少了樣品處理過程對測定結(jié)果可能產(chǎn)生的不利影響。從本研究的實驗樣品測定結(jié)果分析，槲皮素可以完整分子形式透過Caco-2 細胞單層，同時在跨膜轉(zhuǎn)運過程中會發(fā)生進一步的代謝轉(zhuǎn)化，其中，3′-OH 位置的甲基化反應(yīng)較4′-OH位置更廣泛[9]。

綜上所述，本研究建立的同時測定細胞孵育體系中槲皮素及異鼠李亭和檉柳黃素的HPLC/MS測定方法，靈敏度高，樣品處理方法簡單，解決了因常規(guī)樣品處理過程耗時、復(fù)雜以及對不穩(wěn)定化合物測定結(jié)果的影響，且與高效液相色譜比較，大大提高了檢測的靈敏度。