袁堂戰(zhàn)，蔣珂，程海濤，朱湘南

（1.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院普外科，江西 南昌 330003；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江西 南昌 330003）

人類LHX6（LIM homeobox domain 6）基因定位在9號(hào)染色體的q33.2位置，是編碼LIM同源域的一類轉(zhuǎn)錄因子[1]。已有研究表明，LHX6參與了胚胎發(fā)育過程和多器官系統(tǒng)的形態(tài)發(fā)生，包括頭部發(fā)育、顱頜面發(fā)育和生殖細(xì)胞分化等過程，尤其在皮層和海馬中的神經(jīng)元遷移和分化中具有重要功能[2-3]。近些年來，有研究認(rèn)為LHX6基因甲基化可以作為一個(gè)識(shí)別頭頸癌的甲基化標(biāo)記物，而在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中則可能具有重要的早期診斷價(jià)值[4-5]。最近的研究顯示，LHX6在肺癌中是一個(gè)潛在的受DNA甲基化調(diào)控的典型抑癌基因[6]。

肝細(xì)胞癌（以下簡稱肝癌）是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，死因的第3位[7]。在我國，肝癌（HCC）僅次于肺癌，是位列第2位的惡性腫瘤殺手，占我國全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8%。截至目前，已確定了以手術(shù)治療為核心的肝癌綜合治療方案[8]，但目前肝癌的總體治療效果仍難令人滿意，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%（小肝癌也達(dá)40%～50%）[9]。因此，我們有必要探尋新的肝癌分子生物學(xué)標(biāo)記物，為肝癌的靶向治療提供有效的藥物靶點(diǎn)。

LHX6基因在肝癌中的具體抑癌分子機(jī)制以及在臨床預(yù)后中的意義目前還不清楚。前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過對(duì)54例肝癌組織標(biāo)本檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LHX6在肝癌組織中呈顯著低表達(dá)，并且其表達(dá)水平與肝癌臨床病理因素相關(guān)，包括病理分級(jí)、腫瘤大小等。本次研究，我們收集80例肝癌組織標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)染色觀察肝癌侵襲指標(biāo)的表達(dá)狀況，同時(shí)，通過體外和體內(nèi)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，探索LHX6基因在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)、作用、機(jī)制及可能的臨床預(yù)后意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人肝癌細(xì)胞株HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3.1（+）/LHX6重組質(zhì)粒、siRNA-LHX6由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；MTT試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒（美國Bio-Rad Laboratories公司）；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗、PBS（美國Gibco公司）；E-cadherin多克隆抗體、Vimentin多克隆抗體、Snail多克隆抗體（英國Abcam公司）、熒光染料標(biāo)記的680驢抗兔第二抗體、熒光染料標(biāo)記的780羊抗鼠第二抗體、熒光素標(biāo)記兔抗鼠第二抗體（美國LI-COR公司）；免疫組織化學(xué)試劑盒、二胺基聯(lián)苯胺（DAB）顯色盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），ABC試劑盒（美國Vector Lab）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C裸小鼠購自南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，鼠齡6周，體質(zhì)量18～25 g，于室溫22～26℃，相對(duì)濕度40%～60%的SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，墊料、水及飼料均經(jīng)高壓滅菌處理，每3天更換一次，籠具浸泡在1∶1 000的新潔爾滅中消毒。

1.1.3 臨床標(biāo)本 80例臨床肝癌標(biāo)本收集來自于南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，標(biāo)本收集取得患者同意，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色觀察侵襲指標(biāo)的表達(dá)狀況

（1）LHX6基因免疫組化染色：將臨床肝癌標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的連續(xù)切片。常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，經(jīng)甲醇配置的1%H2O2和3%胎牛血清處理；加入LHX6 37℃孵育1 h，置4℃環(huán)境下過夜，PBS洗滌；滴加生物素標(biāo)記第二抗體37℃孵育1 h，PBS洗滌；加ABC 37 ℃ 1 h；DAB顯色，脫水、透明、干燥、封片。

（2）侵襲指標(biāo)免疫組化染色：將臨床肝癌標(biāo)本，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm厚的連續(xù)切片。ECadherin、Vimentin、Snail抗體工作液濃度分別為1∶50、1∶100、1∶50。免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，具體步驟：放置組織切片于烤箱，68℃20 min；常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液高溫抗原熱修復(fù)15 min，冷卻至室溫，3%H2O237℃孵育20min，正常羊血清工作液封閉30 min；依次滴加第一抗體4℃過夜，滴加生物素標(biāo)記第二抗體37℃孵育20 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。

1.2.2 體外肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

（1）細(xì)胞培養(yǎng)：人肝癌細(xì)胞株HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2平衡濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換1次液。當(dāng)觀察到細(xì)胞生長處于對(duì)數(shù)期時(shí)（細(xì)胞生長鋪滿度約為80%時(shí)），然后向培養(yǎng)基內(nèi)加入用0.25%的胰蛋白酶消化約3 min后，使用倒置顯微鏡對(duì)消化細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮、細(xì)胞間期變大，停止消化。制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿器皿的底面后方可應(yīng)用。

（2）LHX6：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及siRNA轉(zhuǎn)染從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取LHX6全基因序列，GI號(hào)：55958142。根據(jù)LHX6基因序列設(shè)計(jì)引物，見表1。

表1 LHX6基因引物名稱Table 1 LHX6 gene primer name

將所需要的轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)?；騭iRNA按照固定比例加入無血清培養(yǎng)液中，輕敲拍打混勻，室溫避光孵育20 min。將轉(zhuǎn)染混合物均勻逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育。在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)約6 h，然后再用含有10%的小牛血清完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）RT-PCR法：按美國Bio-Rad Laboratories公司的實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，微量核酸分析儀測(cè)定RNA濃度和純度；DEPC水將RNA濃度稀釋成1μg/μl，取2 μl行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃4 min進(jìn)行預(yù)變性，95℃20 s進(jìn)行變性，65℃20 s進(jìn)行退火，75℃15 s進(jìn)行延伸，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參。用2-ΔΔCt法計(jì)算LHX6基因的相對(duì)表達(dá)量。

（4）MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集感染后24 h的細(xì)胞，將細(xì)胞重懸，以每孔5×103個(gè)接種于96孔板，每孔200 L，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞0、24、48及72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長活性（以490 nm波長處的吸光度值表示），待測(cè)孔加入20 L MTT，4 h后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入150 L DMSO后水平搖床上輕搖10 min使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長處測(cè)定吸光度值，以MTT比色值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制出各組細(xì)胞的生長曲線。

（5）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力：將處理后的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照2×105/ml的密度，接種入含有玻片的24孔的板內(nèi)，然后將l ml的細(xì)胞懸液加入每孔內(nèi)，輕輕的混勻。在完全培養(yǎng)基上孵育48 h后，然后更換1%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育。然后用100 μl的無菌tip頭在玻片上垂直劃2條平行線，后用PBS清洗1次；分別在培養(yǎng)0 h和48 h時(shí)取玻片觀察。用PBS清洗取出的玻片3次，然后將玻片放進(jìn)用甲醇∶乙酸（3∶1比例）的固定液中約固定30 min后，取出玻片后用PBS清洗3次并晾干。然后使用吉姆薩染液對(duì)玻片進(jìn)行染色15 min后，使用清水清洗玻片，晾干后放置在顯微鏡下拍照觀察。計(jì)算劃痕修復(fù)率。

劃痕修復(fù)率=（0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度×100%。

1.2.3 小鼠肝癌移植模型及腫瘤進(jìn)展觀察

（1）原位肝癌模型（肝門靜脈注射組）：將小鼠分為3組，即空白對(duì)照組、LHX6基因低表達(dá)組以及LHX6基因高表達(dá)組，空白對(duì)照組每組10只小鼠，其余兩組每組15只小鼠，雄性。收集處于生長對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照LHX6基因高低表達(dá)將兩組細(xì)胞分別稀釋至2×106cells/ml，在無菌條件下各取250 μl細(xì)胞懸液對(duì)LHX6基因低表達(dá)組以及LHX6基因高表達(dá)組小鼠進(jìn)行肝門靜脈接種，各接種12只。對(duì)照組小鼠在肝門靜脈接種等量的生理鹽水。每周觀察1次，連續(xù)觀察4周，觀察瘤塊大小、皮下浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腹腔播散情況，記錄皮下腫瘤生長曲線。

（2）皮下肝癌模型（腋部皮下注射組）：皮下動(dòng)物模型則將細(xì)胞懸液接種于腋部皮膚皮下，分組情況、觀察情況與原位肝癌模型一致。

（3）觀察指標(biāo)：接種肝癌細(xì)胞后，觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水等一般狀況及死亡情況。在種植肝癌細(xì)胞后的7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量每次觀察時(shí)皮下腫瘤大小，按下列公式計(jì)算腫瘤體積（tumor volume，TV），TV=0.5×a×b2（其中a、b分別表示長、寬）。

（4）解剖學(xué)及組織病理學(xué)觀察：4周后，采用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行大體解剖觀察，肉眼觀察瘤體的大小、形態(tài)、有無胸腹水及各臟器表面有無轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，稱取瘤體質(zhì)量；分離腫瘤組織，置于40 g/L甲醛中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察瘤組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用“”表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色表達(dá)狀況

2.1.1 LHX6基因、E-cadherin、Vimentin、Snail在肝癌組織及癌旁組織的表達(dá) LHX6基因在肝癌組織中表達(dá)熒光強(qiáng)度值為（0.177±0.086），表達(dá)強(qiáng)度低，而在癌旁組織中表達(dá)量為（0.475±0.212），強(qiáng)度明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。E-cadherin在肝癌組織表達(dá)熒光強(qiáng)度值為（0.093±0.022），較癌旁組織相對(duì)表達(dá)量（0.177±0.127）顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Vimentin在肝癌

組織表達(dá)熒光強(qiáng)度值為（0.702±0.452），較癌旁組織相對(duì)表達(dá)量（0.436±0.115）顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Snail在肝癌組織表達(dá)熒光強(qiáng)度值為（0.633±0.215），較癌旁組織相對(duì)表達(dá)量（0.376±0.201）顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。LHX6基因的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，與Vimentin、Snail的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

2.1.2 免疫組化檢測(cè)LHX6基因、E-Cadherin、Vimentin、Snail在肝癌組織及癌旁組織的表達(dá) 通過鏡下觀察可見LHX6在肝癌組織中表達(dá)較為低下，而相鄰的癌旁組織中呈現(xiàn)較高表達(dá)，表達(dá)主要部位在細(xì)胞核，可見腫瘤細(xì)胞核中大量棕黑色顆粒；E-Cadherin在肝癌組織中幾乎不表達(dá)，而相鄰的癌旁組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，表達(dá)主要部位在細(xì)胞膜，可見紅棕色顆粒圍繞細(xì)胞；Vimentin在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在相鄰的癌旁組織中基本不表達(dá)，表達(dá)主要部位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可見棕黃色顆粒；Snail同樣在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在癌旁組織中基本不表達(dá)，表達(dá)主要部位在細(xì)胞核中，可見核內(nèi)富有棕黃色染色顆粒。

2.1.3 LHX6基因、E-Cadherin、Vimentin、Snail與臨床病理特征和預(yù)后間關(guān)系 利用方差分析檢驗(yàn)可知，肝癌組織中LHX6基因的表達(dá)與包膜侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05）；E-Cadherin的表達(dá)與門脈侵襲、包膜侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)有關(guān)（P＜0.05）；Vimentin的表達(dá)與門脈侵襲、包膜侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)（P＜0.05）；Snail的表達(dá)與門脈侵襲、包膜侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。在預(yù)后方面，LHX6基因、E-Cadherin的高表達(dá)與Vimentin、Snail的低表達(dá)是促進(jìn)肝癌預(yù)后的保護(hù)因素，反之LHX6基因、E-Cadherin的低表達(dá)與Vimentin、Snail的高表達(dá)則是肝癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

2.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)

2.2.1 轉(zhuǎn)染LHX6在HepG2肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 運(yùn)用RT-PCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)染LHX6在HepG2肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組中的LHX6的表達(dá)水平比較結(jié)果差異顯著（P＜0.05），這表明，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以上調(diào)LHX6表達(dá)，而siRNA轉(zhuǎn)染可以下調(diào)LHX6表達(dá)，見圖1。2.2.2 轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系增殖的影響 運(yùn)用MTT方法測(cè)定轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系增殖的影響，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組中的肝癌細(xì)胞增殖情況比較結(jié)果差異顯著（P＜0.05），這表明，高表達(dá)LHX6可以抑制肝癌細(xì)胞增殖，而低表達(dá)LHX6可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，見圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染LHX6在HepG2肝癌細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量Figure1 The Relative Expression Level of Transfected LHX6 in HepG2 Liver Cancer Cell Lines

圖2 轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系增殖的影響Figure 2 Effect of transfection of LHX6 on the proliferation of HepG2 hepatocellular carcinoma cell line

2.2.3 轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系遷移侵襲能力的影響 運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系遷移侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、siRNA轉(zhuǎn)染組中的肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力比較結(jié)果差異顯著（P＜0.05），這表明，高表達(dá)LHX6可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，而低表達(dá)LHX6可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染LHX6對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系遷移侵襲能力的影響Figure 3 Effect of transfected LHX6 on migration and invasive ability of HepG2 hepatoma cell line

2.3 小鼠肝癌移植模型及腫瘤進(jìn)展觀察

2.3.1 原位肝癌模型（肝門靜脈注射組）

（1）移植腫瘤模型成模情況：15只LHX6基因低表達(dá)組小鼠全部移植成功，成瘤率100%；15只LHX6基因高表達(dá)組小鼠中有11只移植成功，成瘤率73.3%；10只對(duì)照組小鼠中無移植成功者，成瘤率0%。實(shí)驗(yàn)按照計(jì)劃完成，無小鼠死亡。LHX6基因低表達(dá)組小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤最大長度已達(dá)18.4 mm；LHX6基因高表達(dá)組小鼠腫瘤生長速度較為緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤最大長度為11.2 mm。

（2）腫瘤生長情況：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱取兩組小鼠腫瘤質(zhì)量，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)LHX6基因低表達(dá)與LHX6基因高表達(dá)所形成的腫瘤質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LHX6基因低表達(dá)組的腫瘤質(zhì)量明顯高于LHX6基因高表達(dá)組，見表2。

表2 各組皮下肝癌模型腫瘤質(zhì)量（）Table 2 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

表2 各組皮下肝癌模型腫瘤質(zhì)量（）Table 2 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

腫瘤質(zhì)量（g）1.606±0.132 0.832±0.064 0組別名稱LHX6基因低表達(dá)組LHX6基因高表達(dá)組空白對(duì)照組

（3）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腹腔播散情況：實(shí)驗(yàn)晚期，LHX6基因低表達(dá)組15只小鼠中，出現(xiàn)肝內(nèi)、皮下、腹腔等廣泛腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例的10例，轉(zhuǎn)移率為66.7%；出現(xiàn)血性腹水者有4例，占26.7%。LHX6基因低表達(dá)組15只小鼠中，出現(xiàn)肝內(nèi)、皮下、腹腔等廣泛腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有3例，轉(zhuǎn)移率為20%；出現(xiàn)血性腹水者有1例，占6.7%。

（4）解剖學(xué)及組織病理學(xué)情況：在本實(shí)驗(yàn)中，瘤體形態(tài)較為規(guī)則，圓形或橢圓形，周圍有完整或不完整的包膜，整體呈現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)狀改變，外周有明顯增粗的血管，較大的瘤體中心則出現(xiàn)干酪樣壞死；晚期則可見肝內(nèi)、皮下及腹腔的廣泛轉(zhuǎn)移。HE染色后可見腫瘤組織呈彌散樣，間質(zhì)內(nèi)有豐富的腫瘤血管，腫瘤邊緣已開始浸潤肝組織；腫瘤細(xì)胞核大，圓形，雙核仁結(jié)構(gòu)明顯，游離核糖體顯著增多，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，與人肝癌細(xì)胞類似。與LHX6基因高表達(dá)組相比，LHX6基因低表達(dá)組的瘤體及鏡下形態(tài)都更為完整典型，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和浸潤情況都更為嚴(yán)重，說明在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，LHX6基因的低表達(dá)是抑制肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)因素。

2.3.2 皮下肝癌模型（腋部皮下注射組）

（1）移植腫瘤模型成模情況：15只LHX6基因低表達(dá)組小鼠全部移植成功，成瘤率100%；15只LHX6基因高表達(dá)組小鼠中有7只移植成功，成瘤率46.7%；15只對(duì)照組小鼠中無移植成功者，成瘤率0%。實(shí)驗(yàn)按照計(jì)劃完成，無小鼠死亡。LHX6基因低表達(dá)組小鼠腫瘤生長較快，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤最大長度已達(dá)12.4 mm；而LHX6基因高表達(dá)組小鼠腫瘤生長速度較為緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)腫瘤最大長度為7.9 mm。

（2）腫瘤生長情況：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算腫瘤體積TV（mm3），并繪制腫瘤生長曲線（圖4），可以發(fā)現(xiàn)：LHX6基因低表達(dá)組腫瘤體積增長速度較快，LHX6基因高表達(dá)組腫瘤體積增長速度較慢，并且隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的發(fā)展，腫瘤增長速度也在增加。經(jīng)方差分析，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.87，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱取兩組小鼠腫瘤質(zhì)量，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)LHX6基因低表達(dá)與LHX6基因高表達(dá)所形成的腫瘤質(zhì)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），LHX6基因低表達(dá)組的腫瘤質(zhì)量明顯高于LHX6基因高表達(dá)組，見表3。

（3）皮下浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況：實(shí)驗(yàn)晚期，LHX6基因低表達(dá)組15只小鼠中，出現(xiàn)皮下浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移例的有10例，轉(zhuǎn)移率為66.7%；LHX6基因高表達(dá)組15只小鼠中，出現(xiàn)皮下浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有4例，轉(zhuǎn)移率為26.7%。皮下肝癌的轉(zhuǎn)移主要沿淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。

圖4 皮下肝癌模型腫瘤生長曲線Figure 4 Subcutaneous hepatocellular carcinoma model tumor growth curve

表3 各組皮下肝癌模型腫瘤質(zhì)量（）Table 3 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

表3 各組皮下肝癌模型腫瘤質(zhì)量（）Table 3 The tumor quality of subcutaneous hepatocellular carcinoma models in each group()

腫瘤質(zhì)量（g）0.514±0.055 0.397±0.081 0組別名稱LHX6基因低表達(dá)組LHX6基因高表達(dá)組空白對(duì)照組

（4）解剖學(xué)及組織病理學(xué)情況 在本實(shí)驗(yàn)中，瘤體呈圓形或類圓形，周圍有完整或不完整的包膜，整體呈大小不等的顆粒狀或結(jié)節(jié)狀改變，部分瘤體可見干酪樣壞死；晚期則出現(xiàn)皮下浸潤和遠(yuǎn)處淋巴轉(zhuǎn)移。HE染色后可見腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，大部分形狀不規(guī)則，有1個(gè)或多個(gè)核仁，核仁結(jié)構(gòu)明顯，病理性核分裂像多見，部分細(xì)胞伴有炎癥細(xì)胞浸潤，與人肝癌細(xì)胞類似。與LHX6基因高表達(dá)組相比，LHX6基因低表達(dá)組的瘤體及鏡下形態(tài)都更為完整典型，皮下浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移都更為嚴(yán)重，說明在本實(shí)驗(yàn)研究條件下，LHX6基因的低表達(dá)是抑制肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的一個(gè)因素。

3 討論

LHX6基因位于人染色體9q33.2位置，全稱是Homo sapiens LIM homeobox 6。其產(chǎn)物屬于LIM蛋白家族，可結(jié)合DNA和蛋白質(zhì)，作為轉(zhuǎn)錄因子存在，在胚胎發(fā)育過程中有重要作用，同時(shí)還與牙齒發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞遷徙定位有關(guān)[10-11]。近些年來新研究表明LHX6基因很可能是頭頸癌的相關(guān)基因[12]，并且在宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤的診斷中可能有重要價(jià)值。盡管如此，LHX6基因在肝癌中的具體分子機(jī)制以及在臨床預(yù)后中的意義目前還不清楚。

前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過對(duì)54例肝癌組織標(biāo)本檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LHX6在肝癌組織中呈顯著低表達(dá)，并且其表達(dá)水平與肝癌臨床病理因素相關(guān)，包括病理分級(jí)、腫瘤大小等。本次實(shí)驗(yàn)中，我們收集80例肝癌組織標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)染色觀察肝癌侵襲指標(biāo)的表達(dá)狀況，同時(shí)進(jìn)行了體外和體內(nèi)的肝癌細(xì)胞培養(yǎng)，從多方面探索LHX6基因在肝癌轉(zhuǎn)移中的表達(dá)、作用以及可能的臨床意義。

肝癌動(dòng)物模型是進(jìn)行肝癌實(shí)驗(yàn)研究的重要手段，目前已經(jīng)建立的模型有動(dòng)物自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植性動(dòng)物肝癌模型、人類肝癌的異種移植模型以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物肝癌模型，本次實(shí)驗(yàn)采用的是移植性肝癌模型。移植性肝癌模型是指能夠在同系、同種或異種動(dòng)物體內(nèi)傳代生長的肝癌，他的組織學(xué)類型、生長特性較穩(wěn)定，侵襲、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療藥物的敏感程度比較容易確定，是目前進(jìn)行腫瘤發(fā)生發(fā)展和抗癌藥物研究的有效方式[13]。本次實(shí)驗(yàn)室用的人肝癌細(xì)胞株HepG2，已經(jīng)廣泛用于相關(guān)藥物與基因?qū)Ω伟┘?xì)胞誘導(dǎo)凋亡以及生物學(xué)性狀的研究，取得了一定的進(jìn)展[14]。同時(shí)有關(guān)研究表明[15]，在肝癌移植模型中，雄性動(dòng)物比雌性動(dòng)物更易引發(fā)肝癌，為了提高腫瘤的形成率，實(shí)驗(yàn)中我們?nèi)渴褂昧诵坌孕∈蟆?/p>

通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，LHX6基因、E-Cadherin的高表達(dá)與Vimentin、Snail的低表達(dá)是促進(jìn)肝癌預(yù)后的保護(hù)因素。高表達(dá)LHX6可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而低表達(dá)LHX6可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。這說明，LHX6與上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變各指標(biāo)具有相關(guān)性，通過促進(jìn)LHX6基因、E-Cadherin的表達(dá)和抑制Vimentin、Snail的表達(dá)有助于提高肝癌的總體治療效果。在未來的肝癌治療中，LHX6基因有可能成為肝癌靶向治療的有效藥物靶點(diǎn)，通過藥物治療上調(diào)LHX6的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為肝癌治療提供一種新途徑，同時(shí)可根據(jù)腫瘤細(xì)胞中LHX6基因表達(dá)的高低判斷預(yù)后情況，調(diào)整治療方案，提高肝癌患者的生存周期及生活質(zhì)量。由于LHX6基因在肝癌發(fā)生發(fā)展上的作用仍不十分明確，其機(jī)制有待進(jìn)一步探究。