孫巖峰，劉偉，沈遠(yuǎn)，楊皛寧，朱惠敏，馬金旭，周瑾△

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 前沿交叉學(xué)科研究室，北京 100080；2.武警總醫(yī)院 兒科 臨床腫瘤，北京 100080)

1 引 言

近年來(lái)，納米生物材料已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[1-2]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)作為石墨烯的衍生物，在醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究得到高度重視。同時(shí)因其表面富含-OH、-COOH、-C=O等大量親水含氧官能團(tuán)，因此，具有良好的水溶性及生物相容性[3-4]。

氧化石墨烯在生物應(yīng)用方面也越來(lái)越廣泛。新近研究表明，氧化石墨烯可與多種生物分子結(jié)合，通過(guò)攜帶小分子藥物、基因、抗體、蛋白等，最終實(shí)現(xiàn)藥物遞送[5-7]。其作為組織工程的支架材料等方面同樣具有一定優(yōu)勢(shì)[8]，已有報(bào)道證實(shí)氧化石墨烯對(duì)骨細(xì)胞的粘附、分化及增殖有一定的影響[9-11]。且石墨烯作為新的涂層材料可加速人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨的分化[12-13]。然而目前成纖維細(xì)胞在氧化石墨烯涂覆基材上的生長(zhǎng)、粘附行為的相關(guān)研究較為少見。成纖維細(xì)胞作為組織工程研究中一種重要的種子細(xì)胞，具有較好的增殖、膠原沉積、細(xì)胞因子的分泌等能力，一定程度上決定著基質(zhì)的重塑和組織構(gòu)架的形成質(zhì)量。因此，探索該材料對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響對(duì)未來(lái)氧化石墨烯在組織工程修復(fù)及重建方面的研究至關(guān)重要。

本研究選取氧化石墨烯作為涂層材料，與明膠混合，制備氧化石墨烯/明膠涂覆材料，并將小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞接種在材料上。本研究旨在探索氧化石墨烯對(duì)NIH3T3細(xì)胞的活性，增殖及粘附等相關(guān)特性的影響，為后續(xù)納米材料在組織工程構(gòu)建方面的生物安全性及生物相容性研究提供參考。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系和試劑

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH3T3。氧化石墨烯(TIME Nano)，高糖DMEM培養(yǎng)液 (HyClone)，0.25%胰蛋白酶(含EDTA，HyClone)，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS，TBD science)，Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁)，細(xì)胞活性染色試劑盒 (Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Toyobo)，實(shí)時(shí)定量 PCR 試劑盒 (Toyobo)。

2.2 方法

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株NIH3T3體外培養(yǎng)于含 10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，隔日換液。細(xì)胞培養(yǎng)至90% 融合時(shí)，按 1:3比例體外傳代培養(yǎng) (37℃，5% CO2)。

2.2.2氧化石墨烯/明膠膜的制備 稱取1 mg氧化石墨烯，加入1 mL明膠(1 mg/mL)，制備1 mg/mL濃度的氧化石墨烯明膠溶液。超聲使其徹底溶解后滴加到細(xì)胞爬片上，置于60℃烘箱中，烘干過(guò)夜。培養(yǎng)細(xì)胞前置于75%乙醇中浸泡消毒過(guò)夜。

2.2.3掃面電鏡檢測(cè)氧化石墨烯/明膠膜的超微結(jié)構(gòu) 將制備的樣品用掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架上生長(zhǎng)的形貌。載物臺(tái)貼上導(dǎo)電膠后，將制備的明膠涂覆材料、氧化石墨烯/明膠涂覆材料貼附在導(dǎo)電膠上后進(jìn)行噴金，掃描電鏡觀察，拍照。

2.2.4細(xì)胞活性檢測(cè) 選取培養(yǎng)了48 h的明膠及氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，添加10%CCK-8試劑，并于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，吸取200 μl孵育液于96孔板中，并利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的OD值。

同時(shí)，選取在氧化石墨烯/明膠膜上培養(yǎng)48 h的NIH3T3細(xì)胞，PBS 沖洗三遍后，根據(jù)活 - 死細(xì)胞染色 (live/deadstaining) 試劑盒操作說(shuō)明，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色1 h，熒光焦顯微鏡(Leica SP8，德國(guó)) 觀察氧化石墨烯/明膠膜上的細(xì)胞活性。

2.2.5細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將細(xì)胞接種到單純明膠組及氧化石墨烯/明膠組涂覆的材料上，分別選取兩組中平行的 3 個(gè)孔，根據(jù)CCK-8試劑操作說(shuō)明，選取培養(yǎng)第1， 3， 5， 7 d的NIH3T3細(xì)胞，分別棄去培養(yǎng)液，添加10% CCK-8試劑并于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)對(duì)應(yīng) OD 值，利用Origin 7.0 軟件擬合，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.2.6vimentin免疫熒光染色 選取培養(yǎng)48 h的明膠及氧化石墨烯/明膠膜上的細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定，依次進(jìn)行脫水，用含0.3% Triton100破膜及用5%山羊血清封閉30 min后加一抗(抗vimentin抗體)，一抗按 1:300 稀釋，加入500 μL，4℃孵育過(guò)夜，隨后用 PBS 清洗3遍后加入二抗(山羊抗小鼠)室溫放置1.5 h，染色后用 PBS浸洗3次，最后加DAPI染細(xì)胞核5 min，用PBS浸洗后，熒光顯微鏡(Leica SP8，德國(guó) )下觀察染色結(jié)果。

2.2.7實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測(cè)粘附相關(guān)的基因表達(dá)水平 收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞，利用 Trizol 法提取細(xì)胞總 RNA，使用RT-PCR kit(Toyobo)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并采用SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit(Toyobo)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。根據(jù)NCBI 中cDNA序列，設(shè)計(jì)引物，以β-actin mRNA作為檢測(cè)的內(nèi)參照，序列：β -Actin：上游：5’ -GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，下游：5’ -CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTT-3’。PCR 反應(yīng)引物序列如下：α -actin：上游：5’-ATCTGGCACCACACCTTCTA-3’，下游：5’-AGCTCGTAGCTCTTCTCCAG-3’;collagen I：上游：5’-ACTGGTACATCAGCCCGAAC-3’；下游：5’ -GGTGGAGGGAGTTTACACGA-3’；collagenIII：上游： 5’ -GCTGGCATTCCTCAGACTTC-3’ ，下游：5’ - TAGTCTCATTGCCTTGCGTG-3’ ；vinculin ：上游：5’ -AGCAGGAGTTGACTCACCAG-3’，下游：5’ -TCTAAGATCTGCCTGATGGC-3’ 。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)體系包括： cDNA 2 μL，引物(1 μmol/L) 2 μL， SYBR green 染料(2×) 10 μL， Nuclease-Free H2O 6 μL，總反應(yīng)體系為 20 μL。反應(yīng)條件：95℃ 30 s， 95℃ 3 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，共42個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)的特異性通過(guò)產(chǎn)物熔解曲線進(jìn)行確認(rèn)，根據(jù) PCR反應(yīng)曲線得到樣品目的基因和β-actin的Ct值。以2-ΔΔCt的值進(jìn)行相對(duì)定量。

2.2.8Western blotting 檢測(cè)Vimentin表達(dá)水平 將培養(yǎng)的細(xì)胞消化離心后得細(xì)胞沉淀，利用 RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 工作液繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，并檢測(cè)樣品濃度。利用12% 分離膠SDS-PAGE將對(duì)應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，脫脂牛奶封閉，一抗 (1:1 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜，T-TBS 清洗，二抗

(1:3000)室溫孵育2 h 后，T-TBS 清洗，滴加發(fā)光液，并在暗室利用顯影液，定影液進(jìn)行條帶顯影。利用 Image J 圖像分析軟件進(jìn)行圖像灰度掃描測(cè)定，得出目的蛋白與內(nèi)參蛋白 (GAPDH)的灰度比值，即為目的蛋白表達(dá)水平的半定量指標(biāo)。

2.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，且計(jì)量資料以 mean±SD 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，*P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 掃描電鏡檢測(cè)材料表面的微觀結(jié)構(gòu)

掃描電鏡結(jié)果顯示單純明膠涂覆材料與氧化石墨烯/明膠材料二者的表面形貌存在較大差異。明膠材料表面光滑，材料表面較為平整，無(wú)明顯褶皺結(jié)構(gòu)存在，見圖1a。而添加氧化石墨烯后，材料表面明顯變得粗糙，氧化石墨烯/明膠膜表面起伏不平整，且存在許多凸起與凹陷，具有明顯的微米級(jí)褶皺結(jié)構(gòu)，但整個(gè)表面較為柔和，見圖1b。這兩種材料表面形貌上的差異很可能是導(dǎo)致細(xì)胞生物學(xué)行為不同的主要原因。

圖1掃面電鏡檢測(cè)材料表面的微觀結(jié)構(gòu)

a.單獨(dú)明膠膜的表面較為光滑；b.氧化石墨烯/明膠膜表面起伏不平，較為粗糙

Fig1Themicrostructureofthematerialwasexaminedbyscanningelectronmicroscopy

a. The microstructure of the gelatin membrane was smooth. b.The microstructure of GO/gelatin membrane was rough

3.2 活性及生長(zhǎng)曲線分析

NIH3T3細(xì)胞接種到明膠及氧化石墨烯/明膠膜上，Live/Dead Staining結(jié)果顯示，在培養(yǎng)48 h后，氧化石墨烯/明膠膜上的NIH3T3細(xì)胞分布均勻，清晰，絕大部分被染上綠色熒光，細(xì)胞活性良好，而被染上紅色的死細(xì)胞較少，證明該材料的細(xì)胞生物相容性較好，見圖2a。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與明膠組相比，接種在氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細(xì)胞活性良好，對(duì)細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性，見圖2b。

生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組材料上測(cè)定的細(xì)胞吸光度值均增高，間接表明粘附的細(xì)胞數(shù)逐漸增多。且在培養(yǎng)的第3，5，7 d時(shí)，氧化石墨烯/明膠培養(yǎng)組的細(xì)胞吸光度值均高于單純明膠組，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯增殖現(xiàn)象，見圖2c。

3.3 材料表面細(xì)胞Vimentin基因及蛋白的表達(dá)

為了檢測(cè)NIH3T3細(xì)胞在氧化石墨烯/明膠膜上的粘附，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞vimentin的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，GO/gelatin材料表面的vimentin mRNA的表達(dá)顯著提高(**P<0.01),見圖3a。進(jìn)一步利用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞vimentin的表達(dá)，結(jié)果顯示：在氧化石墨烯/明膠膜的NIH3T3細(xì)胞顯示出完整的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，且與單純明膠組相比，能清晰的觀察到細(xì)胞偽足延伸，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)更為清晰。而明膠組中的細(xì)胞未有明顯的細(xì)胞骨架延伸，見圖3b。同時(shí)，我們利用Westernblotting進(jìn)行了Vimentin蛋白表達(dá)的驗(yàn)證，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的Vimentin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1.6倍(*P<0.05)，見圖3c。

圖2 明膠及氧化石墨烯/明膠膜上NIH3T3細(xì)胞的活性及增殖能力檢測(cè)

Fig2TheactivityandproliferationofNIH3T3cellsongelatinandgraphene/gelatinmembranesweredetected

a. Cell viability was observed by live-dead staining； b. Cell viability on cell gelatin and graphene/gelatin membrane was detected by CCK-8； c. Growth curve of the NIF3T3 cells on gelatin and graphene/gelatin membrane was detected by CCK-8 kit

圖3 NIH3T3細(xì)胞在不同材料上Vimentin的表達(dá)水平

Fig3TheexpressionlevelsofVimentinofNIH3T3cellsongelatinandGO/gelatinmembraneswasobserved

a. The expression levels of Vimentin of NIH3T3 cells was detected by RT-QPCR； b. by Western blotting； c. The expression levels of Vimentin of NIH3T3 cells was detected by Immunofluorescence

3.4 細(xì)胞粘附相關(guān)基因表達(dá)

實(shí)時(shí)定量 RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與單純明膠培養(yǎng)組相比，加入氧化石墨烯后培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及Vinculin mRNA的表達(dá)均顯著增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05)，見圖4。

圖4不同材料上NIH3T3細(xì)胞α-actin、ColⅠ、ColⅢ、及VinculinmRNA表達(dá)水平。

Fig4Expressionlevelsofα-actin、ColⅠ、ColⅢandVinculinmRNAofNIH3T3cellsindifferentgroupsdetectedbyrealtimeRT-PCR.Mean±SD,n=3. *P< 0.05; **P<0.01

4 討論

氧化石墨烯作為新興的碳納米材料近年來(lái)受到研究者的廣泛關(guān)注。目前已有大量研究證實(shí)石墨烯在藥物遞送[14]、創(chuàng)傷愈合、組織工程修復(fù)[11，15]等研究中應(yīng)用廣泛。然而對(duì)氧化石墨烯的生物安全性等方面的研究依然處于起步階段，尤其在組織工程方面的研究，其作為植入物的表面涂層材料，對(duì)其生物相容性及安全性的考察至關(guān)重要，還需要研究者進(jìn)一步探討。

本研究嘗試將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系(NIH3T3)接種到氧化石墨烯/明膠膜上，探索氧化石墨烯的生物相容性及對(duì)成纖維細(xì)胞粘附的影響。結(jié)果顯示，加入氧化石墨烯后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)明顯毒性。生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果證實(shí)在氧化石墨烯/明膠膜上培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度明顯高于單獨(dú)明膠培養(yǎng)組。分析原因可能是由于氧化石墨烯/明膠膜大量的凸起與凹陷為成纖維細(xì)胞的增殖提供了更多的空間。且這種機(jī)械性能較強(qiáng)，導(dǎo)電性能較好的納米材料會(huì)在一定程度上調(diào)控細(xì)胞周期的改變進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

利用掃面電鏡檢測(cè)材料表面的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)加入氧化石墨烯后材料表面變得粗糙，推測(cè)這種氧化石墨烯支架材料表面形成的納米和微米級(jí)的褶皺結(jié)構(gòu)可能會(huì)在一定程度上增強(qiáng)細(xì)胞與材料的表面接觸面積，以及粘附強(qiáng)度的增加。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了氧化石墨烯的摻入的確可以使成纖維細(xì)胞分泌更多的膠原，以及增強(qiáng)細(xì)胞在材料表面的伸展、粘附。而這種特性更有利于研究者進(jìn)一步將氧化石墨烯作為植入物的表面涂層材料，推動(dòng)其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

本研究通過(guò)比較二維明膠膜及氧化石墨烯/明膠薄膜對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和粘附的影響，發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯/膠原薄膜可以有效的促進(jìn)細(xì)胞增殖、粘附和延伸。進(jìn)一步證實(shí)氧化石墨烯作為植入物的表面涂層材料，具有很高的生物應(yīng)用潛力，顯示出較好的生物相容性。